מטבולומיקה המבדילה בין גושים ריאתיים שפירים וממאירים עם סגוליות גבוהה באמצעות ניתוח מסה ספקטרומטרי ברזולוציה גבוהה של סרום המטופל.

אבחנה מבדלת של גושים ריאתיים שזוהו באמצעות טומוגרפיה ממוחשבת (CT) נותרה אתגר בפרקטיקה הקלינית.כאן, אנו מאפיינים את המטבולום הגלובלי של 480 דגימות סרום, כולל בקרות בריאות, קשרי ריאות שפירים ואדנוקרצינומה בריאותית בשלב I.אדנוקרצינומות מציגות פרופילים מטבולומיים ייחודיים, בעוד לגושים שפירים ולאנשים בריאים יש דמיון גבוה בפרופילים מטבולומיים.בקבוצת הגילוי (n=306), זוהתה קבוצה של 27 מטבוליטים כדי להבדיל בין גושים שפירים לממאירים.ה-AUC של המודל המבחין בקבוצות האימות הפנימי (n=104) ואימות החיצוני (n=111) היה 0.915 ו-0.945, בהתאמה.ניתוח נתיב חשף מטבוליטים גליקוליטים מוגברים הקשורים לירידה בטריפטופן בסרום אדנוקרצינומה של הריאות בהשוואה לגושים שפירים ובקרות בריאות, והציע כי ספיגת טריפטופן מעודדת גליקוליזה בתאי סרטן ריאות.המחקר שלנו מדגיש את הערך של סמנים ביולוגיים של מטבוליטים בסרום בהערכת הסיכון של גושים ריאתיים שזוהו על ידי CT.
אבחון מוקדם הוא קריטי לשיפור שיעורי ההישרדות של חולי סרטן.תוצאות מניסוי הסקר הלאומי לסרטן ריאות בארה"ב (NLST) וממחקר NELSON האירופי הראו כי בדיקה באמצעות טומוגרפיה ממוחשבת במינון נמוך (LDCT) יכולה להפחית משמעותית את התמותה מסרטן ריאות בקבוצות בסיכון גבוה1,2,3.מאז השימוש הנרחב ב-LDCT לבדיקת סרטן ריאות, השכיחות של ממצאים רדיוגרפיים מקריים של גושים ריאתיים אסימפטומטיים המשיכה לעלות 4 .גושים ריאתיים מוגדרים כאטימות מוקדית של עד 3 ס"מ בקוטר 5 .אנו מתמודדים עם קשיים בהערכת הסבירות לממאירות ובהתמודדות עם המספר הגדול של גושים ריאתיים שזוהו במקרה ב-LDCT.מגבלות של CT יכולות להוביל לבדיקות מעקב תכופות ולתוצאות חיוביות שגויות, מה שמוביל להתערבות מיותרת וטיפול יתר6.לכן, יש צורך לפתח סמנים ביולוגיים אמינים ושימושיים לזיהוי נכון של סרטן ריאות בשלבים המוקדמים ולהבדיל בין רוב הגושים השפירים בזיהוי ראשוני 7 .
ניתוח מולקולרי מקיף של דם (סרום, פלזמה, תאים מונו-גרעיניים בדם היקפי), כולל גנומיקה, פרוטאומיקה או מתילציה של DNA8,9,10, הוביל להתעניינות גוברת בגילוי סמנים ביולוגיים אבחנתיים לסרטן ריאות.בינתיים, גישות מטבולומיקה מודדות תוצרי קצה תאיים המושפעים מפעולות אנדוגניות ואקסוגניות ולכן מיושמות כדי לחזות את הופעת המחלה ותוצאותיה.ספקטרומטריית כרומטוגרפיה נוזלית-טנדם מסה (LC-MS) היא שיטה בשימוש נרחב למחקרי מטבולומיקה בשל הרגישות הגבוהה והטווח הדינמי הגדול שלה, שיכולה לכסות מטבוליטים בעלי תכונות פיזיקוכימיות שונות11,12,13.למרות שניתוח מטבולומי גלובלי של פלזמה/סרום שימש לזיהוי סמנים ביולוגיים הקשורים לאבחון סרטן ריאות14,15,16,17 וליעילות הטיפול, 18 מסווגים של מטבוליטים בסרום כדי להבחין בין גושי ריאות שפירים לממאירים נותרו מחקרים רבים.-מחקר מסיבי.
אדנוקרצינומה וקרצינומה של תאי קשקש הם שני תת-הסוגים העיקריים של סרטן ריאות של תאים לא קטנים (NSCLC).בדיקות סקר CT שונות מצביעות על כך שאדנוקרצינומה היא הסוג ההיסטולוגי הנפוץ ביותר של סרטן ריאות1,19,20,21.במחקר זה, השתמשנו בכרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים אולטרה-ביצועים בספקטרומטריית מסה ברזולוציה גבוהה (UPLC-HRMS) כדי לבצע ניתוח מטבולומי על סך של 695 דגימות סרום, כולל בקרות בריאות, גושים ריאתיים שפירים ו-CT מזוהה ≤3 ס"מ.סקר לאדנוקרצינומה בריאותית בשלב I.זיהינו פאנל של מטבוליטים בסרום המבדילים בין אדנוקרצינומה של הריאות לבין גושים שפירים ובקרות בריאות.ניתוח העשרה של הנתיב גילה שחילוף חומרים חריג של טריפטופן וגלוקוז הם שינויים שכיחים באדנוקרצינומה של הריאות בהשוואה לגושים שפירים ובקרות בריאות.לבסוף, הקמנו ואימתנו סיווג מטבולי בסרום עם סגוליות ורגישות גבוהות כדי להבחין בין גושים ריאתיים ממאירים ושפירים שזוהו על ידי LDCT, מה שעשוי לסייע באבחון מבדל מוקדם והערכת סיכונים.
במחקר הנוכחי, דגימות סרום תואמות מין וגיל נאספו רטרוספקטיבית מ-174 מטופלים בריאים, 292 מטופלים עם גושים ריאתיים שפירים ו-229 מטופלים עם אדנוקרצינומה בריאותית בשלב I.מאפיינים דמוגרפיים של 695 הנבדקים מוצגים בטבלה משלימה 1.
כפי שמוצג באיור 1a, סה"כ 480 דגימות נסיוב, כולל 174 בקרה בריאים (HC), 170 גושים שפירים (BN) ו-136 דגימות של אדנוקרצינומה ריאה בשלב I (LA), נאספו במרכז הסרטן של אוניברסיטת Sun Yat-sen.קבוצת גילוי ליצירת פרופיל מטבולומי לא ממוקד באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים אולטרה-ספקטרומטריית מסה ברזולוציה גבוהה (UPLC-HRMS).כפי שמוצג באיור משלים 1, מטבוליטים דיפרנציאליים בין LA ו-HC, LA ו-BN זוהו כדי לבסס מודל סיווג ולחקור עוד ניתוח מסלול דיפרנציאלי.104 דגימות שנאספו על ידי מרכז הסרטן של אוניברסיטת Sun Yat-sen ו-111 דגימות שנאספו על ידי שני בתי חולים אחרים עברו אימות פנימי וחיצוני, בהתאמה.
אוכלוסיית מחקר בקבוצת הגילוי שעברה ניתוח מטבולומי גלובלי בסרום תוך שימוש בספקטרומטריית מסה ברזולוציה גבוהה (UPLC-HRMS) עם ביצועים אולטרה-פרפורמטיביים של נוזלים.ב אנליזה חלקית של מבחנים בריבועים קטנים (PLS-DA) של המטבולום הכולל של 480 דגימות סרום מקבוצת המחקר, כולל בקרות בריאות (HC, n = 174), גושים שפירים (BN, n = 170) ואדנוקרצינומה ריאה בשלב I (לוס אנג'לס, n = 136).+ESI, מצב יינון אלקטרוספריי חיובי, -ESI, מצב יינון אלקטרוספריי שלילי.c–e מטבוליטים בעלי שפע שונה באופן מובהק בשתי קבוצות נתונות (בדיקת דרגה בעלת שני זנבות של Wilcoxon, שיעור גילוי שגוי מותאם p value, FDR <0.05) מוצגים באדום (שינוי קיפול > 1.2) וכחול (שינוי קיפול < 0.83) .) מוצג בגרפיקת הר הגעש.f מפת חום מקבץ היררכית המציגה הבדלים משמעותיים במספר המטבוליטים המוערים בין LA ל-BN.נתוני מקור מסופקים בצורה של קבצי נתוני מקור.
מטבולום הסרום הכולל של 174 HC, 170 BN ו-136 LA בקבוצת הגילוי נותח באמצעות ניתוח UPLC-HRMS.תחילה אנו מראים שדגימות בקרת איכות (QC) מתקבצות בחוזקה במרכזו של מודל ניתוח רכיבים עיקריים ללא פיקוח (PCA), המאשר את היציבות של ביצועי המחקר הנוכחי (איור משלים 2).
כפי שמוצג בניתוח החלקי המבדיל הריבועים הקטנים ביותר (PLS-DA) באיור 1 ב, מצאנו שיש הבדלים ברורים בין LA ו-BN, LA ו-HC במצבי יינון אלקטרוספריי חיובי (+ESI) ושלילי (-ESI) .מְבוּדָד.עם זאת, לא נמצאו הבדלים משמעותיים בין BN ו-HC במצבי +ESI ו-ESI.
מצאנו 382 מאפיינים דיפרנציאליים בין LA ל-HC, 231 מאפיינים דיפרנציאליים בין LA ל-BN, ו-95 מאפיינים דיפרנציאליים בין BN ל-HC (מבחן דרגה חתום על ידי Wilcoxon, FDR <0.05 ושינוי מרובה >1.2 או <0.83) (איור .1c-e) )..פסגות צוינו עוד יותר (נתונים משלימים 3) כנגד מסד נתונים (ספריית mzCloud/HMDB/Chemspider) לפי ערך m/z, זמן שמירה וחיפוש ספקטרום מסה פיצול (פרטים המתוארים בסעיף שיטות) 22 .לבסוף, 33 ו-38 מטבוליטים מוערים עם הבדלים משמעותיים בשפע זוהו עבור LA לעומת BN (איור 1f וטבלה משלימה 2) ו-LA לעומת HC (איור משלים 3 וטבלה משלימה 2), בהתאמה.לעומת זאת, רק 3 מטבוליטים עם הבדלים משמעותיים בשפע זוהו ב-BN וב-HC (טבלה משלימה 2), בהתאם לחפיפה בין BN ל-HC ב-PLS-DA.מטבוליטים דיפרנציאליים אלה מכסים מגוון רחב של חומרים ביוכימיים (איור משלים 4).ביחד, תוצאות אלו מדגימות שינויים משמעותיים במטבולום בסרום המשקפים טרנספורמציה ממאירה של סרטן ריאות בשלב מוקדם בהשוואה לגושים שפירים של הריאה או נבדקים בריאים.בינתיים, הדמיון של מטבולום הסרום של BN ו-HC מצביע על כך שגושיות ריאתיות שפירות עשויות לחלוק מאפיינים ביולוגיים רבים עם אנשים בריאים.בהתחשב בעובדה שמוטציות גנים של קולטן גורם גדילה באפידרמיס (EGFR) שכיחות בתת-סוג 23 של אדנוקרצינומה של הריאות, ביקשנו לקבוע את ההשפעה של מוטציות נהג על המטבולום בסרום.לאחר מכן ניתחנו את הפרופיל המטבולומי הכולל של 72 מקרים עם סטטוס EGFR בקבוצת אדנוקרצינומת הריאות.מעניין לציין שמצאנו פרופילים דומים בין חולים מוטנטיים EGFR (n=41) ומטופלים מסוג EGFR (n=31) בניתוח PCA (איור משלים 5a).עם זאת, זיהינו 7 מטבוליטים ששכיחותם השתנתה באופן משמעותי בחולים עם מוטציית EGFR בהשוואה לחולים עם EGFR מסוג פרא (מבחן t, p < 0.05 ושינוי קיפול > 1.2 או < 0.83) (איור משלים 5b).רוב המטבוליטים הללו (5 מתוך 7) הם אצילקרניטינים, אשר ממלאים תפקיד חשוב במסלולי חמצון חומצות שומן.
כפי שמודגם בזרימת העבודה המוצגת באיור 2 א, סמנים ביולוגיים לסיווג גושים הושגו באמצעות אופרטורי הצטמקות לפחות מוחלטת ובחירה בהתבסס על 33 מטבוליטים דיפרנציאליים שזוהו ב-LA (n=136) ו-BN (n=170).השילוב הטוב ביותר של משתנים (LASSO) - מודל רגרסיה לוגיסטית בינארי.נעשה שימוש באימות צולב פי עשרה כדי לבדוק את מהימנות המודל.בחירת משתנים והסדרת פרמטרים מותאמים על ידי עונש מקסום סבירות עם פרמטר λ24.ניתוח מטבולומי גלובלי בוצע עוד באופן עצמאי בקבוצות האימות הפנימי (n=104) ואימות החיצוני (n=111) כדי לבדוק את ביצועי הסיווג של המודל המבחין.כתוצאה מכך, 27 מטבוליטים במערך התגליות זוהו כמודל המבחין הטוב ביותר עם ערך ה-AUC הממוצע הגדול ביותר (איור 2b), ביניהם 9 היו בעלי פעילות מוגברת ו-18 ירידה בפעילות ב-LA בהשוואה ל-BN (איור 2c).
זרימת עבודה לבניית מסווג נודולות ריאתי, כולל בחירת הפאנל הטוב ביותר של מטבוליטים בסרום בערכת הגילוי באמצעות מודל רגרסיה לוגיסטית בינארי באמצעות אימות צולב פי עשרה והערכת ביצועים חזויים במערכות אימות פנימיות וחיצוניות.ב סטטיסטיקות אימות צולב של מודל רגרסיה של LASSO לבחירת סמנים ביולוגיים מטבוליים.המספרים שניתנו לעיל מייצגים את המספר הממוצע של סמנים ביולוגיים שנבחרו ב-λ נתון.הקו המקווקו האדום מייצג את ערך ה-AUC הממוצע בלמבדה המתאימה.פסי שגיאה אפורים מייצגים את ערכי ה-AUC המינימליים והמקסימליים.הקו המקווקו מציין את הדגם הטוב ביותר עם 27 הסמנים הביולוגיים שנבחרו.AUC, שטח מתחת לעקומת מאפיין הפעולה של המקלט (ROC).ג שינויים בקיפול של 27 מטבוליטים נבחרים בקבוצת LA בהשוואה לקבוצת BN בקבוצת הגילוי.עמודה אדומה – הפעלה.העמודה הכחולה היא ירידה.עקומות הפעלה של מקלט d–f (ROC) המציגות את כוחו של מודל ההבחנה המבוסס על 27 שילובי מטבוליטים במערכות הגילוי, הפנימיות והחיצוניות.נתוני מקור מסופקים בצורה של קבצי נתוני מקור.
נוצר מודל חיזוי המבוסס על מקדמי הרגרסיה המשוקללים של 27 המטבוליטים הללו (טבלה משלימה 3).ניתוח ROC המבוסס על 27 מטבוליטים אלו הניב ערך שטח מתחת לעקומה (AUC) של 0.933, רגישות קבוצת הגילוי הייתה 0.868, והספציפיות הייתה 0.859 (איור 2ד).בינתיים, בין 38 המטבוליטים הדיפרנציאליים המוערים בין LA ל-HC, קבוצה של 16 מטבוליטים השיגה AUC של 0.902 עם רגישות של 0.801 וסגוליות של 0.856 בהבחנה בין LA ל-HC (איור משלים 6a-c).ערכי AUC המבוססים על ספי שינוי קיפולים שונים עבור מטבוליטים דיפרנציאליים הושוו גם הם.מצאנו שמודל הסיווג התפקד בצורה הטובה ביותר בהבחנה בין LA ל-BN (HC) כאשר רמת השינוי בקיפול נקבעה ל-1.2 לעומת 1.5 או 2.0 (איור משלים 7a,b).מודל הסיווג, המבוסס על 27 קבוצות מטבוליטים, עבר תוקף נוסף בקבוצות פנימיות וחיצוניות.ה-AUC היה 0.915 (רגישות 0.867, סגוליות 0.811) עבור תיקוף פנימי ו-0.945 (רגישות 0.810, ספציפיות 0.979) עבור תיקוף חיצוני (איור 2ה, ו).כדי להעריך יעילות בין-מעבדתית, נותחו 40 דגימות מהקבוצה החיצונית במעבדה חיצונית כמתואר בסעיף השיטות.דיוק הסיווג השיג AUC של 0.925 (איור משלים 8).מכיוון שקרצינומה של תאי קשקש בריאה (LUSC) היא תת-הסוג השני בשכיחותו של סרטן ריאות של תאים לא קטנים (NSCLC) אחרי אדנוקרצינומה של הריאות (LUAD), בדקנו גם את התועלת הפוטנציאלית המאומתת של פרופילים מטבוליים.BN ו-16 מקרים של LUSC.ה-AUC של האפליה בין LUSC ל-BN היה 0.776 (איור משלים 9), המצביע על יכולת ירודה יותר בהשוואה לאפליה בין LUAD ל-BN.
מחקרים הראו שגודל הגושים בתמונות CT נמצא בקורלציה חיובית עם הסבירות לממאירות ונשאר גורם מכריע בטיפול בגושים25,26,27.ניתוח הנתונים מהקבוצה הגדולה של מחקר ההקרנה של NELSON הראה שהסיכון לממאירות בנבדקים עם צמתים <5 מ"מ אפילו דומה לזה שבנבדקים ללא צמתים 28 .לכן, הגודל המינימלי הדורש ניטור CT קבוע הוא 5 מ"מ, כפי שהומלץ על ידי האגודה הבריטית לחזה (BTS), ו-6 מ"מ, כפי שהומלץ על ידי אגודת פליישנר 29 .עם זאת, גושים גדולים מ-6 מ"מ וללא מאפיינים שפירים ברורים, המכונים קשריות ריאתיות בלתי מוגדרות (IPN), נותרו אתגר מרכזי בהערכה ובניהול בפרקטיקה הקלינית30,31.לאחר מכן בדקנו האם גודל הגושים השפיע על חתימות מטבולומיות באמצעות דגימות מאוחדות מקבוצות הגילוי והאימות הפנימי.תוך התמקדות ב-27 סמנים ביולוגיים מאומתים, השווינו תחילה את פרופילי PCA של מטבולומים של HC ו-BN תת-6 מ"מ.מצאנו שרוב נקודות הנתונים עבור HC ו-BN חופפות, מה שמוכיח שרמות המטבוליטים בסרום היו דומות בשתי הקבוצות (איור 3א).מפות התכונה על פני טווחי גדלים שונים נותרו שמורות ב-BN ו-LA (איור 3b, c), בעוד שנצפתה הפרדה בין גושים ממאירים ושפירים בטווח של 6-20 מ"מ (איור 3d).לעוקבה זו היה AUC של 0.927, ספציפיות של 0.868 ורגישות של 0.820 לניבוי ממאירות של גושים בגודל 6 עד 20 מ"מ (איור 3e, F).התוצאות שלנו מראות שהסווג יכול לתפוס שינויים מטבוליים הנגרמים על ידי טרנספורמציה ממאירה מוקדמת, ללא קשר לגודל הגושים.
השוואה של פרופילי PCA בין קבוצות שצוינו על סמך מסווג מטבולי של 27 מטבוליטים.CC ו-BN < 6 מ"מ.b BN < 6 מ"מ לעומת BN 6–20 מ"מ.ב-LA 6-20 מ"מ לעומת LA 20-30 מ"מ.g BN 6-20 מ"מ ו-LA 6-20 מ"מ.GC, n = 174;BN < 6 מ"מ, n = 153;BN 6–20 מ"מ, n = 91;LA 6–20 מ"מ, n = 89;LA 20–30 מ"מ, n = 77. עקומת מאפיין הפעלה של מקלט (ROC) מציגה ביצועי מודל מבחין עבור גושים 6-20 מ"מ.ערכי הסתברות חושבו על סמך מודל הרגרסיה הלוגיסטי עבור גושים בגודל 6-20 מ"מ.הקו המקווקו האפור מייצג את ערך החיתוך האופטימלי (0.455).המספרים שלמעלה מייצגים את אחוז המקרים הצפוי ללוס אנג'לס.השתמש במבחן t דו-זנב של תלמיד.PCA, ניתוח רכיבים עיקריים.אזור AUC מתחת לעקומה.נתוני מקור מסופקים בצורה של קבצי נתוני מקור.
ארבע דגימות (בני 44-61 שנים) בעלות גודל גוש ריאתי דומים (7-9 מ"מ) נבחרו עוד יותר כדי להמחיש את הביצועים של מודל חיזוי הממאירות המוצע (איור 4א, ב).בסריקה ראשונית, מקרה 1 הוצג כגוש מוצק עם הסתיידות, תכונה הקשורה לשפירות, ואילו מקרה 2 הוצג כגוש מוצק חלקית בלתי מוגדר ללא תכונות שפירות ברורות.שלושה סבבים של סריקות CT מעקב הראו שמקרים אלו נותרו יציבים לאורך תקופה של 4 שנים ולכן נחשבו לגושים שפירים (איור 4א).בהשוואה להערכה קלינית של סריקות CT סדרתיות, ניתוח מטבוליטים בסרום עם מודל הסיווג הנוכחי זיהה במהירות ובצורה נכונה את הגושים השפירים הללו על סמך אילוצים הסתברותיים (טבלה 1).איור 4b במקרה 3 מציג גוש עם סימנים של נסיגה פלאורלית, אשר קשורה לרוב לממאירות32.מקרה 4 הוצג כגוש מוצק חלקית בלתי מוגדר ללא עדות לגורם שפיר.כל המקרים הללו נחזו כממאירים על פי מודל המסווגים (טבלה 1).הערכת אדנוקרצינומה של הריאה הודגמה בבדיקה היסטופתולוגית לאחר ניתוח כריתת ריאות (איור 4ב).עבור ערכת האימות החיצונית, המסווג המטבולי חזה במדויק שני מקרים של קשרי ריאה בלתי מוגדרים גדולים מ-6 מ"מ (איור משלים 10).
תמונות CT של החלון הצירי של הריאות של שני מקרים של גושים שפירים.במקרה 1, בדיקת CT לאחר 4 שנים הראתה גוש מוצק יציב בגודל 7 מ"מ עם הסתיידות באונה התחתונה הימנית.במקרה 2, בדיקת CT לאחר 5 שנים גילתה גוש יציב, מוצק חלקית בקוטר 7 מ"מ באונה העליונה הימנית.ב תמונות CT של חלון צירי של הריאות ומחקרים פתולוגיים מקבילים של שני מקרים של אדנוקרצינומה בשלב I לפני כריתת ריאות.במקרה 3 התגלה גוש בקוטר 8 מ"מ באונה העליונה הימנית עם נסיגת פלאורלית.מקרה 4 חשף גומת זכוכית מוצקה חלקית בגודל 9 מ"מ באונה העליונה השמאלית.צביעת המטוקסילין ואאוזין (H&E) של רקמת ריאה שנכרתה (סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר) המדגימה את דפוס הצמיחה האצינרי של אדנוקרצינומה של הריאה.חיצים מציינים גושים שזוהו בתמונות CT.תמונות H&E הן תמונות מייצגות של מספר (>3) שדות מיקרוסקופיים שנבדקו על ידי הפתולוג.
ביחד, התוצאות שלנו מדגימות את הערך הפוטנציאלי של סמנים ביולוגיים של מטבוליטים בסרום באבחון דיפרנציאלי של גושים ריאתיים, שעלולים להוות אתגרים בעת הערכת בדיקת CT.
בהתבסס על פאנל מטבוליטים דיפרנציאלי מאומת, ביקשנו לזהות קורלציות ביולוגיות של שינויים מטבוליים עיקריים.ניתוח העשרה של מסלולי KEGG על ידי MetaboAnalyst זיהה 6 מסלולים נפוצים שהשתנו באופן משמעותי בין שתי הקבוצות הנתונות (LA לעומת HC ו-LA לעומת BN, מותאם p ≤ 0.001, השפעה > 0.01).שינויים אלו אופיינו בהפרעות במטבוליזם של פירובטים, מטבוליזם של טריפטופן, מטבוליזם של ניאצין וניקוטינמיד, גליקוליזה, מחזור TCA ומטבוליזם של פורין (איור 5א).לאחר מכן ביצענו עוד יותר מטבולומיקה ממוקדת כדי לאמת שינויים גדולים באמצעות כימות מוחלט.קביעת מטבוליטים נפוצים במסלולים המשתנים בדרך כלל על ידי ספקטרומטריית מסה משולשת quadrupole (QQQ) תוך שימוש בתקני מטבוליטים אותנטיים.מאפיינים דמוגרפיים של דגימת היעד של מחקר המטבולומיקה נכללים בטבלה משלימה 4. בהתאם לתוצאות המטבולומיקה העולמיות שלנו, ניתוח כמותי אישר כי היפוקסנטין וקסנטין, פירובט ולקטט גדלו ב-LA בהשוואה ל-BN ו-HC (איור 5b, c, p <0.05).עם זאת, לא נמצאו הבדלים משמעותיים במטבוליטים אלו בין BN ו-HC.
ניתוח העשרה של מסלולי KEGG של מטבוליטים שונים באופן משמעותי בקבוצת LA בהשוואה לקבוצות BN ו-HC.נעשה שימוש ב-Globaltest דו-זנב, וערכי p הותאמו בשיטת Holm-Bonferroni (מותאם p ≤ 0.001 וגודל אפקט > 0.01).b-d חלקות כינור המציגות רמות היפוקסנטין, קסנטין, לקטט, פירובט וטריפטופן בסרום HC, BN ו-LA שנקבעו על ידי LC-MS/MS (n = 70 לקבוצה).קווים מנוקדים לבנים ושחורים מציינים את החציון והרבעון, בהתאמה.עלילת כינור המציגה ביטוי מנורמל של Log2TPM (תמלילים למיליון) של SLC7A5 ו-QPRT באדנוקרצינומה של הריאות (n=513) בהשוואה לרקמת ריאה תקינה (n=59) במערך הנתונים של LUAD-TCGA.הקופסה הלבנה מייצגת את הטווח הבין-רבעוני, הקו השחור האופקי במרכז מייצג את החציון, והקו השחור האנכי המשתרע מהקופסה מייצג את רווח הסמך של 95% (CI).f עלילת מתאם Pearson של ביטוי SLC7A5 ו- GAPDH באדנוקרצינומה של הריאות (n=513) ורקמת ריאה תקינה (n=59) במערך הנתונים של TCGA.האזור האפור מייצג את 95% CI.r, מקדם מתאם פירסון.g רמות טריפטופן סלולריות מנורמלות בתאי A549 שעברו transfected עם בקרת shRNA לא ספציפית (NC) ו-shSLC7A5 (Sh1, Sh2) שנקבעו על ידי LC-MS/MS.מוצג ניתוח סטטיסטי של חמש דגימות בלתי תלויות ביולוגית בכל קבוצה.h רמות סלולריות של NADt (סה"כ NAD, כולל NAD+ ו-NADH) בתאי A549 (NC) ו- SLC7A5 נוק-דאון A549 תאי (Sh1, Sh2).מוצג ניתוח סטטיסטי של שלוש דגימות בלתי תלויות ביולוגית בכל קבוצה.הפעילות הגליקוליטית של תאי A549 לפני ואחרי SLC7A5 נמדדה לפי קצב החמצה החוץ-תאי (ECAR) (n = 4 דגימות בלתי תלויות ביולוגית לקבוצה).2-DG,2-דאוקסי-D-גלוקוז.ב-(b–h) נעשה שימוש במבחן t של תלמיד דו-זנב.ב-(g-i), פסי שגיאה מייצגים את הממוצע ± SD, כל ניסוי בוצע שלוש פעמים באופן עצמאי והתוצאות היו דומות.נתוני מקור מסופקים בצורה של קבצי נתוני מקור.
בהתחשב בהשפעה המשמעותית של חילוף חומרים של טריפטופן בקבוצת LA, הערכנו גם את רמות הטריפטופן בסרום בקבוצות HC, BN ו-LA באמצעות QQQ.מצאנו שטריפטופן בסרום הופחת ב-LA בהשוואה ל-HC או BN (p <0.001, איור 5d), מה שעולה בקנה אחד עם ממצאים קודמים לפיהם רמות הטריפטופן במחזור הדם נמוכות יותר בחולים עם סרטן ריאות מאשר בביקורות בריאים מקבוצת הביקורת33,34 ,35.מחקר אחר באמצעות PET/CT tracer 11C-methyl-L-tryptophan מצא שזמן שימור האות של טריפטופן ברקמת סרטן הריאות גדל באופן משמעותי בהשוואה לנגעים שפירים או רקמה תקינה36.אנו משערים שהירידה בטריפטופן בסרום LA עשויה לשקף ספיגת טריפטופן פעילה על ידי תאי סרטן ריאות.
כמו כן, ידוע שהתוצר הסופי של מסלול הקינורן של קטבוליזם טריפטופן הוא NAD+37,38, המהווה מצע חשוב לתגובה של גליצרלדהיד-3-פוספט עם 1,3-ביספוספוגליצרט בגליקוליזה39.בעוד שמחקרים קודמים התמקדו בתפקיד של קטבוליזם טריפטופן בוויסות החיסון, ביקשנו להבהיר את משחק הגומלין בין חוסר ויסות טריפטופן למסלולים גליקוליטים שנצפו במחקר הנוכחי.משפחת טרנספורטרים מומסים 7 חבר 5 (SLC7A5) ידוע כמעביר טריפטופן43,44,45.Quinolinic acid phosphoribosyltransferase (QPRT) הוא אנזים הממוקם במורד מסלול ה-kynurenine הממיר חומצה quinolinic ל-NAMN46.בדיקה של מערך הנתונים של LUAD TCGA גילתה שגם SLC7A5 וגם QPRT היו מווסתים באופן משמעותי ברקמת הגידול בהשוואה לרקמה רגילה (איור 5ה).עלייה זו נצפתה בשלבים I ו-II וכן בשלבים III ו-IV של אדנוקרצינומה של הריאות (איור משלים 11), מה שמצביע על הפרעות מוקדמות במטבוליזם של טריפטופן הקשורות לגידולים.
בנוסף, מערך הנתונים של LUAD-TCGA הראה מתאם חיובי בין ביטוי SLC7A5 ו-GAPDH mRNA בדגימות של חולי סרטן (r = 0.45, p = 1.55E-26, איור 5f).לעומת זאת, לא נמצא מתאם מובהק בין חתימות גנים כאלה ברקמת ריאה תקינה (r=0.25, p=0.06, איור 5f).נוק-דאון של SLC7A5 (איור משלים 12) בתאי A549 הפחית באופן משמעותי את רמות הטריפטופן וה-NAD(H) הסלולרי (איור 5g,h), וכתוצאה מכך פעילות גליקוליטית מוחלשת כפי שנמדדה על ידי קצב החמצה החוץ-תאי (ECAR) (איור 1).5i).לפיכך, בהתבסס על שינויים מטבוליים בסרום ובזיהוי במבחנה, אנו משערים שחילוף החומרים של טריפטופן עשוי לייצר NAD+ דרך מסלול הקינורן ולמלא תפקיד חשוב בקידום הגליקוליזה בסרטן ריאות.
מחקרים הראו שמספר רב של גושים ריאתיים בלתי מוגדרים המזוהים על ידי LDCT עשויים להוביל לצורך בבדיקות נוספות כגון PET-CT, ביופסיית ריאות וטיפול יתר עקב אבחנה חיובית שגויה של ממאירות.31 כפי שמוצג באיור 6, המחקר שלנו זיהה פאנל של מטבוליטים בסרום עם ערך אבחוני פוטנציאלי שעשוי לשפר את ריבוד הסיכון ואת הניהול שלאחר מכן של גושים ריאתיים שזוהו באמצעות CT.
גושים ריאתיים מוערכים באמצעות טומוגרפיה ממוחשבת במינון נמוך (LDCT) עם מאפייני הדמיה המעידים על סיבות שפירות או ממאירות.התוצאה הלא ודאית של גושים עלולה להוביל לביקורי מעקב תכופים, התערבויות מיותרות וטיפול יתר.הכללת מסווגים מטבוליים בסרום עם ערך אבחנתי עשוי לשפר את הערכת הסיכון ואת הניהול לאחר מכן של גושים ריאתיים.טומוגרפיה פליטת פוזיטרונים PET.
נתונים ממחקר NLST האמריקאי וממחקר NELSON האירופי מצביעים על כך שבדיקת קבוצות בסיכון גבוה עם טומוגרפיה ממוחשבת במינון נמוך (LDCT) עשויה להפחית את התמותה מסרטן ריאות1,3.עם זאת, הערכת סיכונים וניהול קליני לאחר מכן של מספר רב של גושים ריאתיים מקריים שזוהו על ידי LDCT נותרו המאתגרים ביותר.המטרה העיקרית היא לייעל את הסיווג הנכון של פרוטוקולים קיימים מבוססי LDCT על ידי שילוב סמנים ביולוגיים אמינים.
סמנים ביולוגיים מולקולריים מסוימים, כגון מטבוליטים בדם, זוהו על ידי השוואת סרטן ריאות עם בקרות בריאות15,17.במחקר הנוכחי, התמקדנו ביישום של ניתוח מטבולומי בסרום כדי להבחין בין קשריות ריאתיות שפירות לממאירות שזוהו אגב על ידי LDCT.השווינו את מטבולום הסרום הגלובלי של שליטה בריאה (HC), קשריות ריאות שפירות (BN) ודגימות אדנוקרצינומה בריאותית בשלב I (LA) באמצעות ניתוח UPLC-HRMS.מצאנו של-HC ו-BN היו פרופילים מטבוליים דומים, בעוד ש-LA הראה שינויים משמעותיים בהשוואה ל-HC ו-BN.זיהינו שתי קבוצות של מטבוליטים בסרום המבדילים בין LA לבין HC ו-BN.
תוכנית הזיהוי הנוכחית מבוססת LDCT עבור גושים שפירים וממאירים מבוססת בעיקר על הגודל, הצפיפות, המורפולוגיה וקצב הגדילה של גושים לאורך זמן30.מחקרים קודמים הראו שגודל הגושים קשור קשר הדוק לסבירות לסרטן ריאות.אפילו בחולים בסיכון גבוה, הסיכון לממאירות בצמתים <6 מ"מ הוא <1%.הסיכון לממאירות עבור גושים בגודל 6 עד 20 מ"מ נע בין 8% ל-64%30.לכן, אגודת פליישנר ממליצה על קוטר חתך של 6 מ"מ למעקב CT שגרתי.29 עם זאת, הערכת סיכונים וניהול של קשריות ריאתיות בלתי מוגדרות (IPN) גדולות מ-6 מ"מ לא בוצעו כראוי 31 .הניהול הנוכחי של מחלת לב מולדת מבוסס בדרך כלל על המתנה ערנית עם ניטור CT תכוף.
בהתבסס על המטבולום המאומת, הדגמנו לראשונה את החפיפה של חתימות מטבולומיות בין אנשים בריאים וגושים שפירים <6 מ"מ.הדמיון הביולוגי עולה בקנה אחד עם ממצאי CT קודמים לפיהם הסיכון לממאירות עבור גושים <6 מ"מ נמוך כמו עבור נבדקים ללא צמתים. 30 יש לציין כי התוצאות שלנו מדגימות גם שלגושים שפירים מתחת ל-6 מ"מ ו-≥6 מ"מ יש גבוהים דמיון בפרופילים מטבולומיים, מה שמצביע על כך שההגדרה התפקודית של אטיולוגיה שפירה עקבית ללא קשר לגודל הגושים.לפיכך, פאנלים מודרניים של מטבוליטים סרום אבחנתיים עשויים לספק בדיקה יחידה כבדיקת ביטול כאשר גושים מתגלים לראשונה ב-CT ועלולים להפחית את הניטור הסדרתי.במקביל, אותו פאנל של סמנים ביולוגיים מטבוליים הבחין בין גושים ממאירים בגודל ≥6 מ"מ לבין גושים שפירים וסיפק תחזיות מדויקות עבור IPNs בגודל דומה ומאפיינים מורפולוגיים מעורפלים בתמונות CT.מסווג חילוף החומרים בנסיוב פעל היטב בחיזוי הממאירות של גושים ≥6 מ"מ עם AUC של 0.927.יחד, התוצאות שלנו מצביעות על כך שחתימות מטבולומיות ייחודיות בסרום עשויות לשקף באופן ספציפי שינויים מטבוליים מוקדמים שנגרמו על ידי גידול ויש להם ערך פוטנציאלי כמנבאי סיכון, ללא תלות בגודל הגושים.
יש לציין כי אדנוקרצינומה של הריאות (LUAD) וקרצינומה של תאי קשקש (LUSC) הם הסוגים העיקריים של סרטן ריאות של תאים לא קטנים (NSCLC).בהתחשב בכך ש-LUSC קשור מאוד לשימוש בטבק47 ו-LUAD היא ההיסטולוגיה הנפוצה ביותר של קשרי ריאות מקריים שזוהו בבדיקת CT48, מודל המסווגים שלנו נבנה במיוחד עבור דגימות אדנוקרצינומה בשלב I.וואנג ועמיתיו גם התמקדו ב-LUAD וזיהו תשע חתימות שומנים המשתמשות ב-lipidomics כדי להבחין בין סרטן ריאות בשלב מוקדם מאנשים בריאים17.בדקנו את מודל הסיווג הנוכחי על 16 מקרים של שלב I LUSC ו-74 גושים שפירים וראינו דיוק חיזוי נמוך של LUSC (AUC 0.776), מה שמצביע על כך ש-LUAD ו-LUSC עשויים להיות בעלי חתימות מטבולומיות משלהם.ואכן, הוכח כי LUAD ו-LUSC נבדלים זה מזה באטיולוגיה, מקור ביולוגי וסטיות גנטיות49.לכן, סוגים אחרים של היסטולוגיה צריכים להיכלל במודלים של אימון לאיתור מבוסס אוכלוסייה של סרטן ריאות בתוכניות סקר.
כאן, זיהינו את ששת המסלולים המשתנים בתדירות הגבוהה ביותר באדנוקרצינומה של הריאות בהשוואה לביקורות בריאות וגושים שפירים.Xanthine והיפוקסנטין הם מטבוליטים נפוצים של המסלול המטבולי של פורין.בהתאם לתוצאות שלנו, תוצרי ביניים הקשורים למטבוליזם של פורין גדלו באופן משמעותי בנסיוב או ברקמות של חולים עם אדנוקרצינומה של הריאות בהשוואה לביקורות בריאות או חולים בשלב הטרום-פולשני15,50.רמות גבוהות של קסנטין והיפוקסנטין בסרום עשויות לשקף את האנבוליזם הנדרש על ידי תאים סרטניים המתרבים במהירות.חוסר ויסות של חילוף החומרים של גלוקוז הוא סימן היכר ידוע של חילוף החומרים בסרטן51.כאן, ראינו עלייה משמעותית בפירובאט ולקטט בקבוצת LA בהשוואה לקבוצת HC ו-BN, מה שעולה בקנה אחד עם דיווחים קודמים על הפרעות במסלול הגליקוליטי בפרופילי המטבולום בסרום של חולי סרטן ריאות של תאים לא קטנים (NSCLC) בקרות בריאות.התוצאות עקביות52,53.
חשוב לציין, ראינו מתאם הפוך בין מטבוליזם של פירובט וטריפטופן בסרום של אדנוקרצינומות בריאות.רמות הטריפטופן בסרום הופחתו בקבוצת LA בהשוואה לקבוצת HC או BN.מעניין לציין שמחקר קודם בקנה מידה גדול באמצעות קבוצה פרוספקטיבית מצא שרמות נמוכות של טריפטופן במחזור היו קשורות לסיכון מוגבר לסרטן ריאות 54 .טריפטופן היא חומצת אמינו חיונית שאנו מקבלים כולה מהמזון.אנו מסיקים כי דלדול טריפטופן בסרום באדנוקרצינומה של הריאות עשוי לשקף דלדול מהיר של מטבוליט זה.ידוע היטב כי התוצר הסופי של קטבוליזם טריפטופן דרך מסלול kynurenine הוא המקור לסינתזה דה נובו של NAD+.מכיוון ש-NAD+ מיוצר בעיקר דרך מסלול ההצלה, נותרה לקבוע את החשיבות של NAD+ במטבוליזם של טריפטופן בבריאות ובמחלות46.הניתוח שלנו של מסד הנתונים של TCGA הראה שהביטוי של טרנספורטר טרנספורטר מומס 7A5 (SLC7A5) גדל באופן משמעותי באדנוקרצינומה של הריאות בהשוואה לביקורות רגילות והיה בקורלציה חיובית עם הביטוי של האנזים הגליקוליטי GAPDH.מחקרים קודמים התמקדו בעיקר בתפקיד של קטבוליזם טריפטופן בדיכוי התגובה החיסונית האנטי-גידולית40,41,42.כאן אנו מדגימים שעיכוב של ספיגת טריפטופן על ידי נפילה של SLC7A5 בתאי סרטן ריאות מביא לירידה שלאחר מכן ברמות ה-NAD הסלולריות ולהפחתה נלווית של הפעילות הגליקוליטית.לסיכום, המחקר שלנו מספק בסיס ביולוגי לשינויים בחילוף החומרים בסרום הקשורים לטרנספורמציה ממאירה של אדנוקרצינומה בריאות.
מוטציות EGFR הן מוטציות הנהג הנפוצות ביותר בחולים עם NSCLC.במחקר שלנו, מצאנו שלחולים עם מוטציה EGFR (n=41) היו פרופילים מטבולומיים כלליים דומים לחולים עם EGFR מסוג פרא (n=31), אם כי מצאנו ירידה ברמות הסרום של חלק מהמטופלים המוטנטים של EGFR בחולי אצילקרניטין.תפקידם המבוסס של אצילקרניטינים הוא להעביר קבוצות אציל מהציטופלזמה אל המטריצה ​​המיטוכונדריאלית, מה שמוביל לחמצון חומצות שומן לייצור אנרגיה 55 .בהתאם לממצאים שלנו, מחקר שנערך לאחרונה זיהה גם פרופילים דומים של מטבולום בין גידולי EGFR מוטנטיים וגידולים מסוג EGFR על ידי ניתוח המטבולום העולמי של 102 דגימות רקמת אדנוקרצינומה של הריאות50.באופן מעניין, תוכן אצילקרניטין נמצא גם בקבוצת המוטנטים EGFR.לכן, האם שינויים ברמות האצילקרניטין משקפים שינויים מטבוליים המושרים על ידי EGFR והמסלולים המולקולריים הבסיסיים עשויים להזדקק למחקר נוסף.
לסיכום, המחקר שלנו מקים סיווג מטבולי בסרום לאבחנה מבדלת של גושים ריאתיים ומציע זרימת עבודה שיכולה לייעל את הערכת הסיכונים ולהקל על ניהול קליני על סמך בדיקת CT.
מחקר זה אושר על ידי ועדת האתיקה של בית החולים לסרטן האוניברסיטאי Sun Yat-sen, בית החולים המסונף הראשון של אוניברסיטת Sun Yat-sen, וועדת האתיקה של בית החולים האוניברסיטאי לסרטן Zhengzhou.בקבוצות הגילוי והאימות הפנימי, נאספו 174 סמים מאנשים בריאים ו-244 סמים מגושים שפירים מאנשים שעוברים בדיקות רפואיות שנתיות במחלקה לבקרת ומניעת סרטן, במרכז הסרטן באוניברסיטת Sun Yat-sen, ו-166 גושים שפירים.נַסיוֹב.אדנוקרצינומות ריאות בשלב I נאספו ממרכז הסרטן של אוניברסיטת Sun Yat-sen.בקוהורט האימות החיצוני, היו 48 מקרים של גושים שפירים, 39 מקרים של אדנוקרצינומה בריאותית בשלב I מבית החולים המסונף הראשון של אוניברסיטת Sun Yat-sen, ו-24 מקרים של אדנוקרצינומה בריאותית בשלב I מבית החולים Zhengzhou Cancer.המרכז לסרטן האוניברסיטאי Sun Yat-sen אסף גם 16 מקרים של סרטן ריאות של תאי קשקש בשלב I כדי לבדוק את יכולת האבחון של המסווג המטבולי שהוקם (מאפייני המטופל מוצגים בטבלה משלימה 5).דגימות מקבוצת הגילוי וקבוצת האימות הפנימית נאספו בין ינואר 2018 למאי 2020. דגימות עבור קבוצת האימות החיצונית נאספו בין אוגוסט 2021 לאוקטובר 2022. כדי למזער הטיה מגדרית, הוקצו מספר שווה של מקרים גברים ונשים לכל אחד קבוצת אנשים.צוות גילוי וצוות ביקורת פנימית.מגדר המשתתף נקבע על סמך דיווח עצמי.התקבלה הסכמה מדעת מכל המשתתפים ולא ניתן פיצוי.נבדקים עם גושים שפירים היו אלה עם ציון סריקת CT יציב לאחר שנתיים עד 5 שנים בזמן הניתוח, למעט מקרה אחד ממדגם האימות החיצוני, שנאסף לפני הניתוח ואובחן על ידי היסטופתולוגיה.למעט ברונכיטיס כרונית.מקרים של אדנוקרצינומה ריאות נאספו לפני כריתת ריאות ואושרו על ידי אבחנה פתולוגית.דגימות דם בצום נאספו בצינורות הפרדה בסרום ללא כל נוגדי קרישה.דגימות דם נקשרו במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר ולאחר מכן עברו צנטריפוגה ב-2851 × גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס כדי לאסוף סופרנטנט בסרום.מנות סרום הוקפאו ב-80 מעלות צלזיוס עד מיצוי מטבוליטים.המחלקה למניעת סרטן ובדיקה רפואית של המרכז לסרטן באוניברסיטת Sun Yat-sen אספה מאגר של נסיוב מ-100 תורמים בריאים, כולל מספר שווה של גברים ונשים בגילאי 40 עד 55 שנים.נפחים שווים של כל דגימת תורם עורבבו, המאגר שהתקבל נחלק ואוחסן ב-80 מעלות צלזיוס.תערובת הסרום שימשה כחומר עזר לבקרת איכות ותקינת נתונים.
סרום ייחוס ודגימות בדיקה הופשרו וחילוץ מטבוליטים בשיטת מיצוי משולבת (MTBE/מתנול/מים) 56 .בקצרה, 50 μl של סרום עורבבו עם 225 μl של מתנול קר כקרח ו-750 μl של מתיל tert-butyl ether (MTBE) קר כקרח.מערבבים את התערובת ומדגרים על קרח למשך שעה.לאחר מכן הדגימות ערבבו וערבבו במערבולת עם 188 μl של מים בדרגת MS המכילים סטנדרטים פנימיים (13C-lactate, 13C3-pyruvate, 13C-methionine, ו-13C6-isoleucine, שנרכשו ממעבדות קיימברידג' איזוטופ).לאחר מכן התערובת עברה צנטריפוגה ב-15,000 × גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס, והשלב התחתון הועבר לשתי צינורות (125 μL כל אחת) לניתוח LC-MS במצבים חיוביים ושליליים.לבסוף, הדגימה התאדה ליובש ברכז ואקום במהירות גבוהה.
המטבוליטים המיובשים רוקנו מחדש ב-120 μl של אצטוטריל 80%, עברו מערבולת במשך 5 דקות, וצנטריפוגה ב-15,000 × גרם למשך 10 דקות ב-4°C.סופרנטנטים הועברו לבקבוקוני זכוכית ענבר עם מיקרו-תוספות למחקרים מטבולומיים.ניתוח מטבולומי לא ממוקד על פלטפורמת ספקטרומטריית מסה ברזולוציה גבוהה (UPLC-HRMS) בעלת ביצועים גבוהים במיוחד.מטבוליטים הופרדו באמצעות מערכת Dionex Ultimate 3000 UPLC ועמודת ACQUITY BEH Amide (2.1 × 100 מ"מ, 1.7 מיקרומטר, ווטרס).במצב יונים חיוביים, השלבים הניידים היו 95% (A) ו-50% אצטוטריל (B), כל אחד מכיל 10 mmol/L אמוניום אצטט ו-0.1% חומצה פורמית.במצב שלילי, פאזות ניידות A ו-B הכילו 95% ו-50% אצטוטריל, בהתאמה, שני השלבים הכילו 10 mmol/L אמוניום אצטט, pH = 9. תוכנית הגרדיאנט הייתה כדלקמן: 0-0.5 דקות, 2% B;0.5–12 דקות, 2–50% B;12-14 דקות, 50-98% B;14-16 דקות, 98% B;16–16.1.דקה, 98 -2% B;16.1-20 דקות, 2% B. העמודה נשמרה ב-40°C והדגימה ב-10°C בדגימה האוטומטית.קצב הזרימה היה 0.3 מ"ל לדקה, נפח ההזרקה היה 3 μl.ספקטרומטר מסה Q-Exactive Orbitrap (Thermo Fisher Scientific) עם מקור יינון אלקטרוספריי (ESI) הופעל במצב סריקה מלאה ויחד עם מצב הניטור ddMS2 כדי לאסוף כמויות גדולות של נתונים.הפרמטרים של MS נקבעו כדלקמן: מתח ריסוס +3.8 קילו וולט/- 3.2 קילו וולט, טמפרטורת נימי 320 מעלות צלזיוס, גז מיגון 40 ארב, גז עזר 10 ארב, טמפרטורת מחמם בדיקה 350 מעלות צלזיוס, טווח סריקה 70-1050 מטר לשעה, פתרון הבעיה.70,000. נתונים נרכשו באמצעות Xcalibur 4.1 (Thermo Fisher Scientific).
כדי להעריך את איכות הנתונים, דגימות בקרת איכות מאוחדות (QC) נוצרו על ידי הסרת מנות של 10 μL של הסופרנטנט מכל דגימה.שש זריקות דגימות בקרת איכות נותחו בתחילת הרצף האנליטי כדי להעריך את היציבות של מערכת UPLC-MS.לאחר מכן, דגימות בקרת איכות מוכנסות מדי פעם לאצווה.כל 11 קבוצות דגימות הסרום במחקר זה נותחו על ידי LC-MS.מנות של תערובת מאגר סרום מ-100 תורמים בריאים שימשו כחומר ייחוס באצוות בהתאמה כדי לנטר את תהליך המיצוי ולהתאים את ההשפעות של אצווה לאצווה.ניתוח מטבולומי לא ממוקד של קבוצת הגילוי, קבוצת האימות הפנימי וקבוצת האימות החיצונית בוצע במרכז מטבולומיקה של אוניברסיטת Sun Yat-sen.המעבדה החיצונית של מרכז הניתוח והבדיקה של אוניברסיטת גואנגדונג ניתחה גם 40 דגימות מהקבוצה החיצונית כדי לבדוק את הביצועים של מודל המסווגן.
לאחר מיצוי וקונסטרוקציה, כמות מוחלטת של מטבוליטים בסרום נמדדה באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים במיוחד-ספקטרומטריית מסה טנדמית (Agilent 6495 triple quadrupole) עם מקור יינון אלקטרוספריי (ESI) במצב ניטור תגובה מרובה (MRM).עמודת ACQUITY BEH Amide (2.1 × 100 מ"מ, 1.7 מיקרומטר, ווטרס) שימשה להפרדת מטבוליטים.השלב הנייד כלל 90% (A) ו-5% אצטוטריל (B) עם 10 mmol/L אמוניום אצטט ותמיסת אמוניה 0.1%.תוכנית ההדרגה הייתה כדלקמן: 0-1.5 דקות, 0% B;1.5-6.5 דקות, 0-15% B;6.5-8 דקות, 15% B;8–8.5 דקות, 15%–0% B;8.5–11.5 דקות, 0%B.העמודה נשמרה ב-40 מעלות צלזיוס והדגימה ב-10 מעלות צלזיוס בדגימה האוטומטית.קצב הזרימה היה 0.3 מ"ל/דקה ונפח ההזרקה היה 1 μL.הפרמטרים של MS נקבעו כדלקמן: מתח נימי ±3.5 קילוואט, לחץ נבולייזר 35 psi, זרימת גז נדן 12 ליטר לדקה, טמפרטורת גז נדן 350 מעלות צלזיוס, טמפרטורת גז ייבוש 250 מעלות צלזיוס, וספיקת גז ייבוש 14 ליטר לדקה.המרות MRM של טריפטופן, פירובט, לקטט, היפוקסנטין וקסנטין היו 205.0-187.9, 87.0-43.4, 89.0-43.3, 135.0-92.3 ו-151.0-107.9 בהתאמה.הנתונים נאספו באמצעות Mass Hunter B.07.00 (Agilent Technologies).עבור דגימות סרום, טריפטופן, פירובט, לקטט, היפוקסנטין וקסנטין כומתו באמצעות עקומות כיול של תמיסות תערובת סטנדרטיות.עבור דגימות תאים, תכולת הטריפטופן נורמלה לתקן הפנימי ולמסת החלבון התא.
מיצוי שיא (m/z וזמן שמירה (RT)) בוצע באמצעות Compound Discovery 3.1 ו-TraceFinder 4.0 (Thermo Fisher Scientific).כדי לבטל הבדלים פוטנציאליים בין אצווה, כל שיא אופייני של מדגם הבדיקה חולק בשיא האופייני של חומר הייחוס מאותה אצווה כדי לקבל את השפע היחסי.סטיות התקן היחסיות של תקנים פנימיים לפני ואחרי תקינה מוצגות בטבלה משלימה 6. הבדלים בין שתי הקבוצות אופיינו בשיעור גילוי שגוי (FDR<0.05, Wilcoxon signed rank test) ושינוי קיפול (>1.2 או <0.83).נתוני טרשת נפוצה גולמיים של התכונות שחולצו ונתוני טרשת נפוצה שתוקנו בסרום מוצגים בנתונים משלימים 1 ובנתונים משלימים 2, בהתאמה.הערת שיא בוצעה בהתבסס על ארבע רמות מוגדרות של זיהוי, כולל מטבוליטים מזוהים, תרכובות עם הערות לכאורה, מחלקות תרכובות מאופיינות לכאורה ותרכובות לא ידועות 22 .בהתבסס על חיפושי מסד נתונים ב-Comound Discovery 3.1 (mzCloud, HMDB, Chemspider), לבסוף נבחרו תרכובות ביולוגיות עם סטנדרטים מאומתים תואמים של MS/MS או הערות התאמה מדויקת ב-mzCloud (ציון > 85) או Chemspider כחומרי ביניים בין המטבולום הדיפרנציאלי.הערות שיא עבור כל תכונה כלולות בנתונים משלימים 3. MetaboAnalyst 5.0 שימש לניתוח חד-משתני של שפע מטבוליטים מנורמל.MetaboAnalyst 5.0 העריך גם ניתוח העשרה של מסלולי KEGG בהתבסס על מטבוליטים שונים באופן משמעותי.ניתוח רכיבים עיקריים (PCA) וניתוח מבחין בריבועים קטנים חלקיים (PLS-DA) נותחו באמצעות חבילת התוכנה ropls (v.1.26.4) עם נורמליזציה של מחסנית ושינוי קנה מידה אוטומטי.מודל סמן הביולוגי האופטימלי לניבוי ממאירות של גושים נוצר באמצעות רגרסיה לוגיסטית בינארית עם אופרטור הצטמקות ובחירה לפחות מוחלטת (LASSO, R package v.4.1-3).הביצועים של מודל ההבחנה במערכות הזיהוי והאימות אופיינו על ידי הערכת AUC בהתבסס על ניתוח ROC לפי חבילת pROC (v.1.18.0.).חתך ההסתברות האופטימלי התקבל על סמך מדד Youden המקסימלי של המודל (רגישות + סגוליות - 1).דגימות בעלות ערכים נמוכים או גדולים מהסף יחזו כגושים שפירים ואדנוקרצינומה בריאותית, בהתאמה.
תאי A549 (#CCL-185, American Type Culture Collection) גודלו במדיום F-12K המכיל 10% FBS.רצפי RNA סיכת ראש קצרים (shRNA) המכוונים ל-SLC7A5 ובקרה לא מכוונת (NC) הוכנסו לוקטור lentiviral pLKO.1-puro.רצפי האנטי-סנס של shSLC7A5 הם כדלקמן: Sh1 (5′-GGAGAAACCTGATGAACAGTT-3′), Sh2 (5′-GCCGTGGACTTCGGGAACTAT-3′).נוגדנים ל-SLC7A5 (#5347) וטובולין (#2148) נרכשו מ- Cell Signaling Technology.נוגדנים ל-SLC7A5 וטובולין שימשו בדילול של 1:1000 לניתוח Western blot.
מבחן הלחץ הגליקוליטי של Seahorse XF מודד את רמות החמצה החוץ-תאית (ECAR).בבדיקה, גלוקוז, אוליגומיצין A ו-2-DG ניתנו ברצף כדי לבדוק את היכולת הגליקוליטית התאית כפי שנמדדה על ידי ECAR.
תאי A549 שהועברו עם שליטה ללא מיקוד (NC) ו-shSLC7A5 (Sh1, Sh2) צופו במשך הלילה בכלים בקוטר 10 ס"מ.מטבוליטים של התא חולצו עם 1 מ"ל של מתנול מימי 80% קר כקרח.תאים בתמיסת המתנול נגרפו, נאספו לתוך צינור חדש, ועברו צנטריפוגה ב-15,000 × גרם למשך 15 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.אסוף 800 μl של supernatant ויבש באמצעות רכז ואקום במהירות גבוהה.לאחר מכן נותחו כדורי המטבוליטים המיובשים עבור רמות טריפטופן באמצעות LC-MS/MS כמתואר לעיל.רמות ה-NAD(H) הסלולריות בתאי A549 (NC ו-shSLC7A5) נמדדו באמצעות ערכה קולורימטרית כמותית NAD+/NADH (#K337, BioVision) לפי הוראות היצרן.רמות החלבון נמדדו עבור כל דגימה כדי לנרמל את כמות המטבוליטים.
לא נעשה שימוש בשיטות סטטיסטיות לקביעה ראשונית של גודל המדגם.מחקרי מטבולומיקה קודמים שמטרתם גילוי סמנים ביולוגיים15,18 נחשבו כמדדים לקביעת גודל, ובהשוואה לדיווחים אלה, המדגם שלנו היה הולם.לא נכללו דגימות מקבוצת המחקר.דגימות נסיוב הוקצו אקראית לקבוצת גילוי (306 מקרים, 74.6%) ולקבוצת אימות פנימית (104 מקרים, 25.4%) עבור מחקרים מטבולומיים לא ממוקדים.כמו כן, בחרנו באקראי 70 מקרים מכל קבוצה מתוך ערכת הגילויים למחקרים מטבולומיים ממוקדים.החוקרים היו עיוורים להקצאה קבוצתית במהלך איסוף וניתוח נתונים של LC-MS.ניתוחים סטטיסטיים של נתוני מטבולומיים וניסויים בתאים מתוארים בסעיפים המתאימים לתוצאות, באגדות איור ושיטות.כימות של טריפטופן תאי, NADT ופעילות גליקוליטית בוצע שלוש פעמים באופן עצמאי עם תוצאות זהות.
למידע נוסף על עיצוב המחקר, עיין בתמצית דוח הפורטפוליו הטבעי המשויך למאמר זה.
נתוני טרשת נפוצה גולמיים של התכונות שחולצו ונתוני הטרשת הנפוצה המנורמלים של סרום ההתייחסות מוצגים בנתונים משלימים 1 ובנתונים משלימים 2, בהתאמה.הערות שיא עבור תכונות דיפרנציאליות מוצגות בנתונים משלימים 3. ניתן להוריד את מערך הנתונים של LUAD TCGA מ-https://portal.gdc.cancer.gov/.נתוני הקלט לשרטוט הגרף מסופקים בנתוני המקור.נתוני מקור מסופקים עבור מאמר זה.
National Lung Screening Study Group, וכו'. הפחתת תמותה מסרטן ריאות עם טומוגרפיה ממוחשבת במינון נמוך.צפון אנגליה.J. Med.365, 395–409 (2011).
קרמר, BS, Berg, KD, Aberle, DR ונביא, PC בדיקת סרטן ריאות באמצעות CT סליל במינון נמוך: תוצאות ממחקר בדיקת הריאות הלאומי (NLST).J. Med.מסך 18, 109–111 (2011).
De Koning, HJ, et al.הפחתת תמותה מסרטן ריאות עם בדיקת CT נפחית בניסוי אקראי.צפון אנגליה.J. Med.382, 503–513 (2020).