מטבולומיקה המבחינה בין גושים ריאתיים שפירים וממאירים עם ספציפיות גבוהה באמצעות ניתוח ספקטרומטרי מסות ברזולוציה גבוהה של סרום המטופל.

אבחנה מבדלת של גושים ריאתיים שזוהו על ידי טומוגרפיה ממוחשבת (CT) נותרה אתגר בפרקטיקה הקלינית. כאן, אנו מאפיינים את המטבולום הגלובלי של 480 דגימות סרום, כולל בקרי ביקורת בריאים, גושים שפירים ריאתיים ואדנוקרצינומה של ריאות בשלב I. אדנוקרצינומות מציגות פרופילים מטבולומיים ייחודיים, בעוד שגושים שפירים ואנשים בריאים בעלי דמיון גבוה בפרופילים המטבולומיים. בקבוצת הגילוי (n = 306), זוהתה קבוצה של 27 מטבוליטים כדי להבדיל בין גושים שפירים לממאירים. AUC של המודל המבחין בקבוצות האימות הפנימי (n = 104) והאימות החיצוני (n = 111) היה 0.915 ו-0.945, בהתאמה. ניתוח מסלול המחלה גילה עלייה במטבוליטים גליקוליטיים הקשורים לירידה בטריפטופן בסרום אדנוקרצינומה של ריאות בהשוואה לגושים שפירים ובקרי ביקורת בריאים, והציע כי ספיגת טריפטופן מקדמת גליקוליזה בתאי סרטן ריאות. המחקר שלנו מדגיש את הערך של סמנים ביולוגיים של מטבוליטים בסרום בהערכת הסיכון לגילוי גושים ריאתיים באמצעות CT.
אבחון מוקדם הוא קריטי לשיפור שיעורי ההישרדות של חולי סרטן. תוצאות הניסוי הלאומי לסקר סרטן ריאות בארה"ב (NLST) ומחקר NELSON האירופי הראו כי סקר באמצעות טומוגרפיה ממוחשבת במינון נמוך (LDCT) יכול להפחית משמעותית את התמותה מסרטן ריאות בקבוצות בסיכון גבוה1,2,3. מאז השימוש הנרחב ב-LDCT לסקר סרטן ריאות, שכיחות הממצאים הרדיולוגיים המקריים של גושים ריאתיים אסימפטומטיים המשיכה לעלות4. גושים ריאתיים מוגדרים כעכירות מוקדית בקוטר של עד 3 ס"מ5. אנו מתמודדים עם קשיים בהערכת הסבירות לממאירות ובהתמודדות עם המספר הרב של גושים ריאתיים המזוהים במקרה ב-LDCT. מגבלות ה-CT עלולות להוביל לבדיקות מעקב תכופות ולתוצאות חיוביות שגויות, מה שמוביל להתערבות מיותרת ולטיפול יתר6. לכן, יש צורך לפתח סמנים ביולוגיים אמינים ושימושיים לזיהוי נכון של סרטן ריאות בשלבים המוקדמים ולהבחנה בין רוב הגושים השפירים בגילוי הראשוני7.
ניתוח מולקולרי מקיף של דם (סרום, פלזמה, תאי חד-גרעין בדם היקפי), כולל גנומיקה, פרוטאומיקה או מתילציה של DNA8,9,10, הוביל לעניין גובר בגילוי סמנים ביולוגיים לאבחון סרטן ריאות. בינתיים, גישות מטבולומיקה מודדות תוצרים סופיים תאיים המושפעים מפעולות אנדוגניות ואקסוגניות ולכן מיושמות לחיזוי הופעת המחלה ותוצאותיה. כרומטוגרפיית נוזלים-ספקטרומטריית מסה טנדם (LC-MS) היא שיטה נפוצה למחקרי מטבולומיקה בשל רגישותה הגבוהה וטווח הדינמי הגדול שלה, שיכולה לכסות מטבוליטים בעלי תכונות פיזיקוכימיות שונות11,12,13. למרות שניתוח מטבולומי גלובלי של פלזמה/סרום שימש לזיהוי סמנים ביולוגיים הקשורים לאבחון סרטן ריאות14,15,16,17 וליעילות הטיפול,18 מסווגים של מטבוליטים בסרום להבחנה בין גושים ריאתיים שפירים לממאירים נותרו נחקרים רבים. -מחקר מסיבי.
אדנוקרצינומה וקרצינומה של תאי קשקש הם שני תת-הסוגים העיקריים של סרטן ריאות שאינו תאים קטנים (NSCLC). בדיקות סקר שונות באמצעות CT מצביעות על כך שאדנוקרצינומה היא הסוג ההיסטולוגי הנפוץ ביותר של סרטן ריאות1,19,20,21. במחקר זה, השתמשנו בכרומטוגרפיית נוזלים בעלת ביצועים גבוהים-ספקטרומטריית מסה ברזולוציה גבוהה (UPLC-HRMS) כדי לבצע ניתוח מטבולומיקה על סך של 695 דגימות סרום, כולל קבוצת ביקורת בריאה, גושים ריאתיים שפירים, וקבוצת ביקורת ≤3 ס"מ שזוהו ב-CT. סקר לאדנוקרצינומה של ריאות בשלב I. זיהינו פאנל של מטבוליטים בסרום המבדילים בין אדנוקרצינומה של ריאות לגושים שפירים ובקרות בריאות. ניתוח העשרת מסלולי הגידול גילה כי מטבוליזם לא תקין של טריפטופן וגלוקוז הם שינויים שכיחים באדנוקרצינומה של ריאות בהשוואה לגושים שפירים ובקרות בריאות. לבסוף, יצרנו ואימתנו מסווג מטבולי בסרום בעל ספציפיות ורגישות גבוהות כדי להבחין בין גושים ריאתיים ממאירים ושפירים שזוהו על ידי LDCT, דבר שעשוי לסייע באבחון מבדל מוקדם ובהערכת סיכונים.
במחקר הנוכחי, נאספו באופן רטרוספקטיבי דגימות סרום תואמות מין וגיל מ-174 קבוצת ביקורת בריאה, 292 חולים עם גושים ריאתיים שפירים ו-229 חולים עם אדנוקרצינומה ריאתית בשלב I. מאפיינים דמוגרפיים של 695 הנבדקים מוצגים בטבלה המשלימה 1.
כפי שמוצג באיור 1א', במרכז הסרטן של אוניברסיטת סון יאט-סן נאספו בסך הכל 480 דגימות סרום, כולל 174 דגימות בקרה בריאות (HC), 170 גושים שפירים (BN) ו-136 דגימות אדנוקרצינומה של ריאות (LA) בשלב I. קבוצת גילוי של פרופיל מטבולומיה לא ממוקדת באמצעות כרומטוגרפיית נוזלים בעלת ביצועים גבוהים עם ספקטרומטריית מסה ברזולוציה גבוהה (UPLC-HRMS). כפי שמוצג באיור המשלים 1, זוהו מטבוליטים דיפרנציאליים בין LA ל-HC, LA ו-BN כדי ליצור מודל סיווג ולחקור עוד יותר ניתוח מסלולים דיפרנציאלי. 104 דגימות שנאספו על ידי מרכז הסרטן של אוניברסיטת סון יאט-סן ו-111 דגימות שנאספו על ידי שני בתי חולים אחרים עברו אימות פנימי וחיצוני, בהתאמה.
א. אוכלוסיית מחקר בקבוצת הגילוי שעברה ניתוח מטבולומיקה גלובלי של סרום באמצעות כרומטוגרפיית נוזלים בעלת ביצועים גבוהים-ספקטרומטריית מסה ברזולוציה גבוהה (UPLC-HRMS). ב. ניתוח ריבועים פחותים חלקיים (PLS-DA) של המטבולום הכולל של 480 דגימות סרום מקבוצת המחקר, כולל קבוצת ביקורת בריאה (HC, n = 174), גושים שפירים (BN, n = 170) ואדנוקרצינומה של ריאות בשלב I (לוס אנג'לס, n = 136). +ESI, מצב יינון אלקטרוספרייס חיובי, -ESI, מצב יינון אלקטרוספרייס שלילי. c-e. מטבוליטים עם שכיחות שונה משמעותית בשתי קבוצות נתונות (מבחן דירוג חתום דו-זנבי של Wilcoxon, ערך p מותאם לשיעור גילוי שגוי, FDR <0.05) מוצגים באדום (שינוי קיפול > 1.2) וכחול (שינוי קיפול < 0.83). ) המוצגים בגרף של הר הגעש. f. מפת חום אשכול היררכית המציגה הבדלים משמעותיים במספר המטבוליטים המבוארים בין LA ל-BN. נתוני המקור מסופקים בצורה של קבצי נתוני מקור.
המטבולומה הכוללת בסרום של 174 HC, 170 BN ו-136 LA בקבוצת הגילוי נותחה באמצעות ניתוח UPLC-HRMS. ראשית, אנו מראים שדגימות בקרת איכות (QC) מקובצות בצפיפות במרכז מודל ניתוח רכיבים עיקריים (PCA) לא מפוקח, מה שמאשר את יציבות ביצועי המחקר הנוכחי (איור משלים 2).
כפי שמוצג בניתוח ריבועים פחותים חלקיים (PLS-DA) באיור 1b, מצאנו כי היו הבדלים ברורים בין LA ל-BN, LA ו-HC במצבי יינון אלקטרוספרייס חיוביים (+ESI) ושליליים (-ESI). עם זאת, לא נמצאו הבדלים משמעותיים בין BN ל-HC בתנאי +ESI ו--ESI.
מצאנו 382 מאפיינים דיפרנציאליים בין LA ל-HC, 231 מאפיינים דיפרנציאליים בין LA ל-BN, ו-95 מאפיינים דיפרנציאליים בין BN ל-HC (מבחן Wilcoxon signed rank, FDR <0.05 ושינוי מרובה >1.2 או <0.83) (איור 1c-e). שיאים סומנו עוד יותר (נתונים משלימים 3) מול מסד נתונים (ספריית mzCloud/HMDB/Chemspider) לפי ערך m/z, זמן שמירה וחיפוש ספקטרום מסות פרגמנטציה (פרטים מתוארים בסעיף שיטות) 22. לבסוף, זוהו 33 ו-38 מטבוליטים מסומנים עם הבדלים משמעותיים בשפע עבור LA לעומת BN (איור 1f וטבלה משלימה 2) ו-LA לעומת HC (איור משלים 3 וטבלה משלימה 2), בהתאמה. לעומת זאת, זוהו רק 3 מטבוליטים עם הבדלים משמעותיים בשפע ב-BN ו-HC (טבלה משלימה 2), דבר התואם את החפיפה בין BN ל-HC ב-PLS-DA. מטבוליטים דיפרנציאליים אלה מכסים מגוון רחב של ביוכימיקלים (איור משלים 4). יחד, תוצאות אלו מדגימות שינויים משמעותיים במטבולומה בסרום המשקפים טרנספורמציה ממאירה של סרטן ריאות בשלב מוקדם בהשוואה לגושים שפירים ריאה או לנבדקים בריאים. בינתיים, הדמיון בין המטבולומה בסרום של BN ו-HC מצביע על כך שגושים שפירים ריאתיים עשויים לחלוק מאפיינים ביולוגיים רבים עם אנשים בריאים. בהתחשב בכך שמוטציות בגן קולטן גורם הגדילה האפידרמלי (EGFR) שכיחות בתת-סוג 23 של אדנוקרצינומה של ריאות, ביקשנו לקבוע את ההשפעה של מוטציות מנהל על המטבולומה בסרום. לאחר מכן ניתחנו את הפרופיל המטבולומי הכולל של 72 מקרים עם סטטוס EGFR בקבוצת אדנוקרצינומה של ריאות. מעניין לציין, שמצאנו פרופילים דומים בין חולי מוטציה EGFR (n = 41) לבין חולי EGFR מסוג בר (n = 31) בניתוח PCA (איור משלים 5a). עם זאת, זיהינו 7 מטבוליטים ששכיחותם השתנתה באופן משמעותי בחולים עם מוטציה ב-EGFR בהשוואה לחולים עם EGFR מסוג בר (מבחן t, p < 0.05 ושינוי קיפול > 1.2 או < 0.83) (איור משלים 5b). רוב המטבוליטים הללו (5 מתוך 7) הם אצילקרניטינים, אשר ממלאים תפקיד חשוב במסלולי חמצון חומצות שומן.
כפי שמודגם בתהליך העבודה המוצג באיור 2 א', סמנים ביולוגיים לסיווג גושים התקבלו באמצעות אופרטורים של הצטמקות מוחלטת מינימלית וסלקציה המבוססת על 33 מטבוליטים דיפרנציאליים שזוהו ב-LA (n = 136) וב-BN (n = 170). שילוב המשתנים הטוב ביותר (LASSO) - מודל רגרסיה לוגיסטית בינארית. אימות צולב פי עשרה שימש לבדיקת מהימנות המודל. בחירת משתנים ורגולריזציה של פרמטרים מותאמים על ידי עונש מקסום סבירות עם פרמטר λ24. ניתוח מטבולומיקה גלובלי בוצע באופן עצמאי בקבוצות האימות הפנימי (n = 104) והאימות החיצוני (n = 111) כדי לבחון את ביצועי הסיווג של מודל ההבחנה. כתוצאה מכך, 27 מטבוליטים במערך הגילוי זוהו כמודל ההבחנה הטוב ביותר עם ערך AUC הממוצע הגדול ביותר (איור 2 ב'), מתוכם 9 בעלי פעילות מוגברת ו-18 בעלי פעילות מופחתת ב-LA בהשוואה ל-BN (איור 2 ג').
תהליך עבודה לבניית מסווג גושים ריאתיים, כולל בחירת הפאנל הטוב ביותר של מטבוליטים בסרום במערך הגילוי באמצעות מודל רגרסיה לוגיסטית בינארית באמצעות אימות צולב פי עשרה והערכת ביצועים ניבוייים במערך אימות פנימי וחיצוני. ב. סטטיסטיקות אימות צולב של מודל רגרסיה LASSO לבחירת סמנים ביולוגיים מטבוליים. המספרים הנתונים לעיל מייצגים את המספר הממוצע של סמנים ביולוגיים שנבחרו ב-λ נתון. הקו המקווקו האדום מייצג את ערך ה-AUC הממוצע ב-lambda המתאים. סרגלי שגיאה אפורים מייצגים את ערכי ה-AUC המינימליים והמקסימליים. הקו המקווקו מציין את המודל הטוב ביותר עם 27 הסמנים הביולוגיים שנבחרו. AUC, השטח מתחת לעקומת מאפיין ההפעלה של המקלט (ROC). ג. שינויים בקיפול של 27 מטבוליטים שנבחרו בקבוצת LA בהשוואה לקבוצת BN בקבוצת הגילוי. עמודה אדומה - הפעלה. העמודה הכחולה היא ירידה. ד-ו. עקומות מאפיין ההפעלה של המקלט (ROC) המראות את עוצמת המודל המבחין על סמך 27 שילובי מטבוליטים במערך האימות הגילוי, הפנימי והחיצוני. נתוני המקור מסופקים בצורה של קבצי נתוני מקור.
מודל חיזוי נוצר על סמך מקדמי הרגרסיה המשוקללים של 27 מטבוליטים אלה (טבלה משלימה 3). ניתוח ROC המבוסס על 27 מטבוליטים אלה הניב ערך שטח מתחת לעקומה (AUC) של 0.933, רגישות קבוצת הגילוי הייתה 0.868, והספציפיות הייתה 0.859 (איור 2ד). בינתיים, מבין 38 המטבוליטים הדיפרנציאליים המבוארים בין LA ל-HC, קבוצה של 16 מטבוליטים השיגה AUC של 0.902 עם רגישות של 0.801 וספציפיות של 0.856 בהבחנה בין LA ל-HC (איור משלים 6א'-ג'). כמו כן הושוו ערכי AUC המבוססים על ספי שינוי קיפול שונים עבור מטבוליטים דיפרנציאליים. מצאנו שמודל הסיווג ביצע בצורה הטובה ביותר בהבחנה בין LA ל-BN (HC) כאשר רמת שינוי הקיפול נקבעה ל-1.2 לעומת 1.5 או 2.0 (איור משלים 7א',ב'). מודל הסיווג, המבוסס על 27 קבוצות מטבוליטים, עבר אומת נוסף בקבוצות פנימיות וחיצוניות. ערך AUC היה 0.915 (רגישות 0.867, ספציפיות 0.811) עבור אימות פנימי ו-0.945 (רגישות 0.810, ספציפיות 0.979) עבור אימות חיצוני (איור 2e, f). כדי להעריך את יעילות המעבדה הבין-מעבדתית, נותחו 40 דגימות מהקבוצה החיצונית במעבדה חיצונית כמתואר בסעיף השיטות. דיוק הסיווג השיג AUC של 0.925 (איור משלים 8). מכיוון שקרצינומה של תאי קשקש ריאתיים (LUSC) היא תת-הסוג השני בשכיחותו של סרטן ריאות שאינו תאים קטנים (NSCLC) לאחר אדנוקרצינומה של ריאות (LUAD), בדקנו גם את התועלת הפוטנציאלית המאומתת של פרופילים מטבוליים. BN ו-16 מקרים של LUSC. ערך AUC של הבחנה בין LUSC ל-BN היה 0.776 (איור משלים 9), דבר המצביע על יכולת נמוכה יותר בהשוואה להבחנה בין LUAD ל-BN.
מחקרים הראו כי גודל הגושים בתמונות CT נמצא בקורלציה חיובית עם הסבירות לגידול ממאיר ונשאר גורם מכריע בטיפול בגושים25,26,27. ניתוח נתונים מקבוצה גדולה של מחקר הסינון NELSON הראה כי הסיכון לגידול ממאיר בנבדקים עם בלוטות <5 מ"מ היה דומה אף לזה שבנבדקים ללא בלוטות28. לכן, הגודל המינימלי הדורש ניטור CT קבוע הוא 5 מ"מ, כפי שמומלץ על ידי האגודה הבריטית לחזה (BTS), ו-6 מ"מ, כפי שמומלץ על ידי אגודת פליישנר29. עם זאת, גושים גדולים מ-6 מ"מ וללא מאפיינים שפירים ברורים, הנקראים גושים ריאתיים בלתי מוגדרים (IPN), נותרו אתגר מרכזי בהערכה ובניהול בפרקטיקה הקלינית30,31. לאחר מכן בדקנו האם גודל הגושים השפיע על חתימות מטבוליות באמצעות דגימות מאוחדות מקבוצות הגילוי והאימות הפנימי. תוך התמקדות ב-27 סמנים ביולוגיים מאומתים, השווינו תחילה את פרופילי PCA של מטבולים של HC ו-BN מתחת ל-6 מ"מ. מצאנו שרוב נקודות הנתונים עבור HC ו-BN חפפו, דבר המדגים שרמות המטבוליטים בסרום היו דומות בשתי הקבוצות (איור 3א'). מפות המאפיינים בטווחי גודל שונים נותרו נשמרות ב-BN וב-LA (איור 3ב', ג'), בעוד שנצפה הפרדה בין גושים ממאירים ושפירים בטווח של 6-20 מ"מ (איור 3ד'). לקבוצה זו היה AUC של 0.927, ספציפיות של 0.868 ורגישות של 0.820 לחיזוי ממאירות של גושים בגודל 6 עד 20 מ"מ (איור 3ה', ו'). תוצאותינו מראות שהמסווג יכול ללכוד שינויים מטבוליים הנגרמים על ידי טרנספורמציה ממאירה מוקדמת, ללא קשר לגודל הגוש.
השוואה של פרופילי PCA בין קבוצות ספציפיות המבוססת על מסווג מטבולי של 27 מטבוליטים. CC ו-BN < 6 מ"מ. b BN < 6 מ"מ לעומת BN 6-20 מ"מ. ב-LA 6-20 מ"מ לעומת LA 20-30 מ"מ. g BN 6-20 מ"מ ו-LA 6-20 מ"מ. GC, n = 174; BN < 6 מ"מ, n = 153; BN 6-20 מ"מ, n = 91; LA 6-20 מ"מ, n = 89; LA 20-30 מ"מ, n = 77. e עקומת מאפיין הפעלה של המקלט (ROC) המציגה את ביצועי המודל המבחין עבור גושים בגודל 6-20 מ"מ. f ערכי הסתברות חושבו על סמך מודל רגרסיה לוגיסטית עבור גושים בגודל 6-20 מ"מ. הקו המקווקו האפור מייצג את ערך החיתוך האופטימלי (0.455). המספרים לעיל מייצגים את אחוז המקרים הצפויים בלוס אנג'לס. השתמש במבחן t דו-צדדי של סטודנט. PCA, ניתוח רכיבים ראשיים. שטח AUC מתחת לעקומה. נתוני המקור מסופקים בצורה של קבצי נתוני מקור.
ארבע דגימות (בגילאי 44-61 שנים) עם גדלי גושים ריאתיים דומים (7-9 מ"מ) נבחרו בנוסף כדי להמחיש את ביצועי מודל חיזוי הממאירות המוצע (איור 4א', 4ב'). בסינון הראשוני, מקרה 1 הוצג כגושים מוצקים עם הסתיידות, מאפיין המקושר לשפירות, בעוד שמקרה 2 הוצג כגושים מוצקים חלקית בלתי מוגדרים ללא מאפיינים שפירים ברורים. שלושה סבבים של סריקות CT מעקב הראו שמקרים אלה נותרו יציבים לאורך תקופה של 4 שנים ולכן נחשבו לגושים שפירים (איור 4א'). בהשוואה להערכה קלינית של סריקות CT סדרתיות, ניתוח מטבוליטים בסרום חד-פעמי עם מודל המסווג הנוכחי זיהה במהירות ובנכונות את הגושים השפירים הללו על סמך אילוצים הסתברותיים (טבלה 1). איור 4ב' במקרה 3 מציג גושים עם סימנים של נסיגת פלאורלית, שלרוב קשורה לממאירות32. מקרה 4 הוצג כגושים מוצקים חלקית בלתי מוגדרים ללא עדות לסיבה שפירה. כל המקרים הללו ניבאו כממאירים לפי מודל המסווג (טבלה 1). הערכת אדנוקרצינומה של הריאות הודגמה על ידי בדיקה היסטופתולוגית לאחר ניתוח כריתת ריאות (איור 4ב'). עבור קבוצת האימות החיצוני, המסווג המטבולי ניבא במדויק שני מקרים של גושים ריאתיים לא מוגדרים גדולים מ-6 מ"מ (איור משלים 10).
תמונות CT של החלון הצירי של הריאות בשני מקרים של גושים שפירים. במקרה 1, סריקת CT לאחר 4 שנים הראתה גוש מוצק ויציב בגודל 7 מ"מ עם הסתיידות באונה הימנית התחתונה. במקרה 2, סריקת CT לאחר 5 שנים חשפה גוש יציב, מוצק חלקית, בקוטר 7 מ"מ באונה הימנית העליונה. b תמונות CT של הריאות עם חלון צירי ומחקרים פתולוגיים מקבילים של שני מקרים של אדנוקרצינומה בשלב I לפני כריתת ריאה. מקרה 3 גילה גוש בקוטר 8 מ"מ באונה הימנית העליונה עם נסיגה פלאורלית. מקרה 4 גילה גוש זכוכית שקוף מוצק חלקית בגודל 9 מ"מ באונה השמאלית העליונה. צביעת המטוקסילין ואאוזין (H&E) של רקמת ריאה שנכרתה (סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר) מדגימה את דפוס הגדילה האצינרי של אדנוקרצינומה של ריאה. חצים מצביעים על גושים שזוהו בתמונות CT. תמונות H&E הן תמונות מייצגות של שדות מיקרוסקופיים מרובים (>3) שנבדקו על ידי הפתולוג.
יחד, תוצאותינו מדגימות את הערך הפוטנציאלי של סמנים ביולוגיים של מטבוליטים בסרום באבחנה המבדלת של גושים ריאתיים, דבר שעשוי להוות אתגרים בעת הערכת בדיקות CT.
בהתבסס על פאנל מטבוליטים דיפרנציאלי מאומת, ביקשנו לזהות קורלציות ביולוגיות של שינויים מטבוליים עיקריים. ניתוח העשרת מסלולי KEGG על ידי MetaboAnalyst זיהה 6 מסלולים נפוצים שעברו שינוי משמעותי בין שתי הקבוצות הנתונים (LA לעומת HC ו-LA לעומת BN, p מותאם ≤ 0.001, השפעה > 0.01). שינויים אלה התאפיינו בהפרעות במטבוליזם של פירובט, מטבוליזם של טריפטופן, מטבוליזם של ניאצין וניקוטינאמיד, גליקוליזה, מחזור TCA ומטבוליזם של פורינים (איור 5a). לאחר מכן ביצענו מטבולומיקה ממוקדת כדי לאמת שינויים עיקריים באמצעות כימות מוחלט. קביעת מטבוליטים נפוצים במסלולים שעברו שינויים נפוצים על ידי ספקטרומטריית מסה משולשת קוואדרופול (QQQ) תוך שימוש בסטנדרטים אותנטיים של מטבוליטים. מאפיינים דמוגרפיים של מדגם היעד של מחקר המטבולומיקה כלולים בטבלה המשלימה 4. בהתאם לתוצאות המטבולומיקה הגלובליות שלנו, ניתוח כמותי אישר כי רמות היפוקסנטין וקסנטין, פירובט ולקטט היו מוגברות ב-LA בהשוואה ל-BN ול-HC (איור 5b, c, p <0.05). עם זאת, לא נמצאו הבדלים משמעותיים במטבוליטים אלה בין BN ל-HC.
ניתוח העשרת מסלול KEGG של מטבוליטים שונים באופן משמעותי בקבוצת LA בהשוואה לקבוצות BN ו-HC. נעשה שימוש ב-Globaltest דו-צדדי, וערכי p הותאמו באמצעות שיטת Holm-Bonferroni (p מותאם ≤ 0.001 וגודל אפקט > 0.01). b–d תרשימי כינור המציגים רמות היפוקסנטין, קסנטין, לקטט, פירובט וטריפטופן בסרום HC, BN ו-LA שנקבעו על ידי LC-MS/MS (n = 70 לכל קבוצה). קווים מקווקווים לבנים ושחורים מציינים את החציון והרבעון, בהתאמה. e תרשימי כינור המציגים ביטוי mRNA Log2TPM (תעתיקים למיליון) מנורמל של SLC7A5 ו-QPRT באדנוקרצינומה של ריאה (n = 513) בהשוואה לרקמת ריאה תקינה (n = 59) במערך הנתונים LUAD-TCGA. התיבה הלבנה מייצגת את הטווח הבין-רבעוני, הקו השחור האופקי במרכז מייצג את החציון, והקו השחור האנכי היוצא מהתיבה מייצג את רווח הסמך של 95%. f עלילת קורלציה של פירסון של ביטוי SLC7A5 ו-GAPDH באדנוקרצינומה של ריאות (n = 513) וברקמת ריאה תקינה (n = 59) במערך הנתונים של TCGA. האזור האפור מייצג את רווח הסמך של 95%. r, מקדם הקורלציה של פירסון. g רמות טריפטופן תאיות מנורמלות בתאי A549 שעברו טרנספקציה עם בקרת shRNA לא ספציפית (NC) ו-shSLC7A5 (Sh1, Sh2) שנקבעו על ידי LC-MS/MS. מוצג ניתוח סטטיסטי של חמש דגימות בלתי תלויות ביולוגית בכל קבוצה. h רמות תאיות של NADt (סה"כ NAD, כולל NAD+ ו-NADH) בתאי A549 (NC) ותאי A549 שעברו נוקאאוט של SLC7A5 (Sh1, Sh2). מוצג ניתוח סטטיסטי של שלוש דגימות בלתי תלויות ביולוגית בכל קבוצה. i הפעילות הגליקוליטית של תאי A549 לפני ואחרי הפלת SLC7A5 נמדדה על ידי קצב החמצה חוץ-תאית (ECAR) (n = 4 דגימות בלתי תלויות ביולוגית לכל קבוצה). 2-DG,2-דאוקסיל-D-גלוקוז. מבחן t דו-צדדי של סטודנט שימש ב-(b-h). ב-(g-i), סרגלי שגיאה מייצגים את הממוצע ± סטיית תקן, כל ניסוי בוצע שלוש פעמים באופן עצמאי והתוצאות היו דומות. נתוני המקור מסופקים בצורת קבצי נתוני מקור.
בהתחשב בהשפעה המשמעותית של שינוי במטבוליזם הטריפטופן בקבוצת LA, הערכנו גם את רמות הטריפטופן בסרום בקבוצות HC, BN ו-LA באמצעות QQQ. מצאנו כי רמות הטריפטופן בסרום היו מופחתות ב-LA בהשוואה ל-HC או BN (p < 0.001, איור 5d), דבר התואם ממצאים קודמים לפיהם רמות הטריפטופן במחזור הדם נמוכות יותר בחולים עם סרטן ריאות בהשוואה לקבוצת ביקורת בריאה מקבוצת הביקורת33,34,35. מחקר נוסף שהשתמש ב-PET/CT tracer 11C-methyl-L-tryptophan מצא כי זמן שמירת אות הטריפטופן ברקמת סרטן ריאות היה גבוה משמעותית בהשוואה לפגיעות שפירות או לרקמה תקינה36. אנו משערים כי הירידה בטריפטופן בסרום LA עשויה לשקף ספיגה פעילה של טריפטופן על ידי תאי סרטן ריאות.
ידוע גם שהתוצר הסופי של מסלול הקינורנין בקטבוליזם של טריפטופן הוא NAD+37,38, שהוא מצע חשוב לתגובה של גליצראלדהיד-3-פוספט עם 1,3-ביספוספוגליצרט בגליקוליזה39. בעוד שמחקרים קודמים התמקדו בתפקיד הקטבוליזם של טריפטופן בוויסות מערכת החיסון, ביקשנו להבהיר את יחסי הגומלין בין חוסר ויסות של טריפטופן למסלולים גליקוליטיים שנצפו במחקר הנוכחי. משפחת מוליכי מומסים חבר 5 (SLC7A5) ידועה כמוליכי טריפטופן43,44,45. חומצה כינולינית פוספוריבוזילטרנספראז (QPRT) הוא אנזים הממוקם במורד הזרם של מסלול הקינורנין אשר ממיר חומצה כינולינית ל-NAMN46. בדיקה של מערך הנתונים LUAD TCGA גילתה כי גם SLC7A5 וגם QPRT היו מווסתים באופן משמעותי כלפי מעלה ברקמת הגידול בהשוואה לרקמה רגילה (איור 5e). עלייה זו נצפתה בשלבים I ו-II וכן בשלבים III ו-IV של אדנוקרצינומה של ריאות (איור משלים 11), דבר המצביע על הפרעות מוקדמות בחילוף החומרים של טריפטופן הקשורות ליצירת גידולים.
בנוסף, מערך הנתונים LUAD-TCGA הראה מתאם חיובי בין ביטוי mRNA של SLC7A5 ו-GAPDH בדגימות חולי סרטן (r = 0.45, p = 1.55E-26, איור 5f). לעומת זאת, לא נמצא מתאם משמעותי בין חתימות גנים כאלה ברקמת ריאה תקינה (r = 0.25, p = 0.06, איור 5f). פירוק של SLC7A5 (איור משלים 12) בתאי A549 הפחית משמעותית את רמות הטריפטופן וה-NAD(H) התאיות (איור 5g,h), וכתוצאה מכך פעילות גליקולית מוחלשת כפי שנמדדה על ידי קצב החמצה חוץ-תאית (ECAR) (איור 1). 5i). לפיכך, בהתבסס על שינויים מטבוליים בסרום וגילוי חוץ-תאי, אנו משערים כי מטבוליזם של טריפטופן עשוי לייצר NAD+ דרך מסלול הקינורנין ולמלא תפקיד חשוב בקידום גליקוליזה בסרטן ריאות.
מחקרים הראו כי מספר רב של גושים ריאתיים לא מוגדרים שזוהו על ידי LDCT עלול להוביל לצורך בבדיקות נוספות כגון PET-CT, ביופסיה של ריאה וטיפול יתר עקב אבחנה חיובית כוזבת של ממאירות.31 כפי שמוצג באיור 6, המחקר שלנו זיהה פאנל של מטבוליטים בסרום בעלי ערך אבחוני פוטנציאלי שעשויים לשפר את ריבוד הסיכון ואת הטיפול לאחר מכן בגושים ריאתיים שזוהו על ידי CT.
גושים ריאתיים מוערכים באמצעות טומוגרפיה ממוחשבת במינון נמוך (LDCT) עם מאפייני הדמיה המצביעים על סיבות שפירות או ממאירות. התוצאה הלא ודאית של גושים יכולה להוביל לביקורי מעקב תכופים, התערבויות מיותרות וטיפול יתר. הכללת מסווגים מטבוליים בסרום בעלי ערך אבחוני עשויה לשפר את הערכת הסיכונים ואת הטיפול לאחר מכן בגושים ריאתיים. טומוגרפיית פליטת פוזיטרונים PET.
נתונים ממחקר NLST האמריקאי וממחקר NELSON האירופי מצביעים על כך שסריקה לקבוצות בסיכון גבוה באמצעות טומוגרפיה ממוחשבת במינון נמוך (LDCT) עשויה להפחית את התמותה מסרטן ריאות1,3. עם זאת, הערכת סיכונים וניהול קליני לאחר מכן של מספר רב של גושים ריאתיים מקריים שזוהו על ידי LDCT נותרו המאתגרים ביותר. המטרה העיקרית היא לייעל את הסיווג הנכון של פרוטוקולים קיימים מבוססי LDCT על ידי שילוב סמנים ביולוגיים אמינים.
סמנים ביולוגיים מולקולריים מסוימים, כגון מטבוליטים בדם, זוהו על ידי השוואת סרטן ריאות עם בקרה בריאה15,17. במחקר הנוכחי, התמקדנו ביישום של ניתוח מטבולומיקה בסרום כדי להבחין בין גושים ריאתיים שפירים וממאירים שזוהו במקרה על ידי LDCT. השווינו את המטבולומה הכללית בסרום של בקרה בריאה (HC), גושים ריאתיים שפירים (BN) ודגימות אדנוקרצינומה של ריאות (LA) בשלב I באמצעות ניתוח UPLC-HRMS. מצאנו כי ל-HC ול-BN היו פרופילים מטבוליים דומים, בעוד של-LA הראה שינויים משמעותיים בהשוואה ל-HC ול-BN. זיהינו שתי קבוצות של מטבוליטים בסרום המבדילים בין LA ל-HC ו-BN.
שיטת הזיהוי הנוכחית המבוססת על LDCT עבור גושים שפירים וממאירים מבוססת בעיקר על גודל, צפיפות, מורפולוגיה וקצב גדילה של גושים לאורך זמן30. מחקרים קודמים הראו שגודל הגושים קשור קשר הדוק לסבירות לסרטן ריאות. אפילו בחולים בסיכון גבוה, הסיכון לממאירות בבלוטות <6 מ"מ הוא <1%. הסיכון לממאירות עבור גושים בגודל 6 עד 20 מ"מ נע בין 8% ל-64%30. לכן, אגודת פליישנר ממליצה על קוטר סף של 6 מ"מ למעקב CT שגרתי.29 עם זאת, הערכת סיכונים וניהול של גושים ריאתיים בלתי מוגדרים (IPN) הגדולים מ-6 מ"מ לא בוצעו כראוי31. הטיפול הנוכחי במחלות לב מולדות מבוסס בדרך כלל על המתנה מעריכה עם ניטור CT תכוף.
בהתבסס על המטבולום המאומת, הדגמנו לראשונה את החפיפה של חתימות מטבולומיות בין אנשים בריאים לבין גושים שפירים <6 מ"מ. הדמיון הביולוגי עולה בקנה אחד עם ממצאים קודמים בסריקת CT לפיהם הסיכון לממאירות עבור גושים <6 מ"מ נמוך כמו עבור נבדקים ללא בלוטות.30 יש לציין כי תוצאותינו מראות גם כי לגושים שפירים <6 מ"מ ו-6 מ"מ ≥ יש דמיון גבוה בפרופילים המטבולומיים, דבר המצביע על כך שההגדרה התפקודית של אטיולוגיה שפירה עקבית ללא קשר לגודל הגוש. לפיכך, פאנלים מודרניים של מטבוליטים בסרום עשויים לספק בדיקה יחידה כמבחן שלילה כאשר גושים מזוהים בתחילה ב-CT, ובכך להפחית באופן פוטנציאלי את הניטור הסדרתי. במקביל, אותו פאנל של סמנים ביולוגיים מטבוליים הבחין בין גושים ממאירים בגודל 6 מ"מ ≥ לבין גושים שפירים וסיפק תחזיות מדויקות עבור IPNs בגודל דומה ותכונות מורפולוגיות מעורפלות בתמונות CT. מסווג מטבוליזם בסרום זה ביצע היטב בניבוי הממאירות של גושים ≥6 מ"מ עם AUC של 0.927. לסיכום, תוצאותינו מצביעות על כך שחתימות מטבולומיות ייחודיות בסרום עשויות לשקף באופן ספציפי שינויים מטבוליים מוקדמים הנגרמים על ידי גידול, ויש להן ערך פוטנציאלי כגורמי ניבוי סיכון, ללא קשר לגודל הגושים.
ראוי לציין כי אדנוקרצינומה של ריאות (LUAD) וקרצינומה של תאי קשקש (LUSC) הן הסוגים העיקריים של סרטן ריאות שאינו מסוג תאים קטנים (NSCLC). בהתחשב בכך ש-LUSC קשור קשר הדוק לשימוש בטבק47 ו-LUAD הוא ההיסטולוגיה הנפוצה ביותר של גושים ריאתיים מקריים שהתגלו בבדיקת CT48, מודל המסווג שלנו נבנה במיוחד עבור דגימות אדנוקרצינומה בשלב I. וואנג ועמיתיו התמקדו גם ב-LUAD וזיהו תשעה חתימות שומנים באמצעות ליפידומיקה כדי להבחין בין סרטן ריאות בשלב מוקדם לבין אנשים בריאים17. בדקנו את מודל המסווג הנוכחי על 16 מקרים של LUSC בשלב I ו-74 גושים שפירים וצפינו בדיוק ניבוי נמוך של LUSC (AUC 0.776), דבר המצביע על כך של-LUAD ול-LUSC עשויות להיות חתימות מטבולומיות משלהם. ואכן, LUAD ו-LUSC הוכחו כשונים באטיולוגיה, במקור הביולוגי ובסטיות גנטיות49. לכן, יש לכלול סוגים אחרים של היסטולוגיה במודלי אימון לגילוי מבוסס אוכלוסייה של סרטן ריאות בתוכניות סקר.
כאן, זיהינו את ששת המסלולים המשתנים בתדירות הגבוהה ביותר באדנוקרצינומה של ריאה בהשוואה לקבוצת ביקורת בריאה ולגושים שפירים. קסנטין והיפוקסנטין הם מטבוליטים נפוצים של מסלול חילוף החומרים של פורינים. בהתאם לתוצאותינו, תוצרי ביניים הקשורים לחילוף חומרים של פורינים היו מוגברים משמעותית בסרום או ברקמות של חולים עם אדנוקרצינומה של ריאה בהשוואה לקבוצת ביקורת בריאה או חולים בשלב טרום-פולשני15,50. רמות גבוהות של קסנטין והיפוקסנטין בסרום עשויות לשקף את האנבוליזם הנדרש על ידי תאי סרטן המתרבים במהירות. חוסר ויסות של מטבוליזם של גלוקוז הוא סימן היכר ידוע של מטבוליזם של סרטן51. כאן, צפינו בעלייה משמעותית בפירובט ולקטט בקבוצת LA בהשוואה לקבוצת HC ו-BN, דבר התואם דיווחים קודמים על חריגות במסלול הגליקוליטי בפרופילי המטבולומיה בסרום של חולי סרטן ריאות מסוג תאים שאינם קטנים (NSCLC) וקבוצת ביקורת בריאה. התוצאות עקביות52,53.
חשוב לציין, שצפינו בקורלציה הפוכה בין מטבוליזם של פירובט לטריפטופן בסרום של אדנוקרצינומות ריאה. רמות הטריפטופן בסרום היו נמוכות יותר בקבוצת LA בהשוואה לקבוצת HC או BN. מעניין לציין, שמחקר בקנה מידה גדול קודם שנעשה באמצעות קבוצה פרוספקטיבית מצא שרמות נמוכות של טריפטופן במחזור הדם היו קשורות לסיכון מוגבר לסרטן ריאות 54. טריפטופן היא חומצת אמינו חיונית שאנו מקבלים כולה מהמזון. אנו מסיקים כי דלדול טריפטופן בסרום באדנוקרצינומה ריאתית עשוי לשקף דלדול מהיר של מטבוליט זה. ידוע היטב כי התוצר הסופי של קטבוליזם טריפטופן דרך מסלול הקינורןין הוא המקור לסינתזת NAD+ de novo. מכיוון ש-NAD+ מיוצר בעיקר דרך מסלול ההצלה, חשיבותו של NAD+ במטבוליזם של טריפטופן בבריאות ובמחלות נותרה לא ברורה 46. הניתוח שלנו של מסד הנתונים של TCGA הראה כי הביטוי של מוליך הטריפטופן 7A5 (SLC7A5) היה מוגבר משמעותית באדנוקרצינומה של ריאות בהשוואה לקבוצת ביקורת רגילה, והיה בקורלציה חיובית עם הביטוי של האנזים הגליקוליטי GAPDH. מחקרים קודמים התמקדו בעיקר בתפקיד הקטבוליזם של טריפטופן בדיכוי התגובה החיסונית האנטי-גידולית40,41,42. כאן אנו מדגימים כי עיכוב ספיגת טריפטופן על ידי דיכוי SLC7A5 בתאי סרטן ריאות גורם לירידה לאחר מכן ברמות NAD תאיות ולהיחלשות נלווית של הפעילות הגליקוליטית. לסיכום, המחקר שלנו מספק בסיס ביולוגי לשינויים בחילוף החומרים בסרום הקשורים לטרנספורמציה ממאירה של אדנוקרצינומה של ריאות.
מוטציות EGFR הן המוטציות הגורמות הנפוצות ביותר בחולים עם NSCLC. במחקר שלנו, מצאנו כי לחולים עם מוטציה ב-EGFR (n = 41) היו פרופילים מטבוליים כלליים דומים לחולים עם EGFR מסוג בר (n = 31), למרות שמצאנו רמות נמוכות יותר בסרום אצל חלק מהחולים עם מוטציה ב-EGFR בחולי אצילקרניטין. התפקיד המוכח של אצילקרניטין הוא להעביר קבוצות אציל מהציטופלזמה אל המטריצה ​​המיטוכונדריאלית, מה שמוביל לחמצון של חומצות שומן לייצור אנרגיה 55. בהתאם לממצאינו, מחקר שנערך לאחרונה זיהה גם פרופילים דומים של מטבולומים בין גידולים עם מוטציה ב-EGFR לבין גידולים מסוג בר ב-EGFR על ידי ניתוח המטבולום הגלובלי של 102 דגימות רקמה של אדנוקרצינומה של ריאה 50. מעניין לציין, שתכולת אצילקרניטין נמצאה גם בקבוצת המוטציה ב-EGFR. לכן, האם שינויים ברמות האצילקרניטין משקפים שינויים מטבוליים הנגרמים על ידי EGFR ואת המסלולים המולקולריים הבסיסיים עשויה להצדיק מחקר נוסף.
לסיכום, המחקר שלנו קובע מסווג מטבולי בסרום לאבחון מבדל של גושים ריאתיים ומציע תהליך עבודה שיכול לייעל את הערכת הסיכונים ולהקל על הטיפול הקליני המבוסס על סריקת CT.
מחקר זה אושר על ידי ועדת האתיקה של בית החולים לסרטן של אוניברסיטת סון יאט-סן, בית החולים המסונף הראשון של אוניברסיטת סון יאט-סן, וועדת האתיקה של בית החולים לסרטן של אוניברסיטת ג'נגג'ואו. בקבוצות הגילוי והאימות הפנימי, נאספו 174 סרומים מאנשים בריאים ו-244 סרומים מגושים שפירים מאנשים שעברו בדיקות רפואיות שנתיות במחלקה לבקרת סרטן ומניעתו, מרכז הסרטן של אוניברסיטת סון יאט-סן, ו-166 גושים שפירים בסרום. אדנוקרצינומות ריאה בשלב I נאספו ממרכז הסרטן של אוניברסיטת סון יאט-סן. בקבוצת האימות החיצוני, היו 48 מקרים של גושים שפירים, 39 מקרים של אדנוקרצינומה ריאה בשלב I מבית החולים המסונף הראשון של אוניברסיטת סון יאט-סן, ו-24 מקרים של אדנוקרצינומה ריאה בשלב I מבית החולים לסרטן ג'נגג'ואו. מרכז הסרטן של אוניברסיטת סון יאט-סן אסף גם 16 מקרים של סרטן ריאות תאי קשקש בשלב I כדי לבחון את יכולת האבחון של המסווג המטבולי שנקבע (מאפייני המטופלים מוצגים בטבלה המשלימה 5). דגימות מקבוצת הגילוי ומקבוצת האימות הפנימי נאספו בין ינואר 2018 למאי 2020. דגימות עבור קבוצת האימות החיצונית נאספו בין אוגוסט 2021 לאוקטובר 2022. כדי למזער הטיה מגדרית, מספר שווה בקירוב של מקרים גברים ונשים הוקצו לכל קבוצה. צוות גילוי וצוות סקירה פנימי. מין המשתתפים נקבע על סמך דיווח עצמי. הסכמה מדעת התקבלה מכל המשתתפים ולא ניתן פיצוי. נבדקים עם גושים שפירים היו אלו עם ציון סריקת CT יציב לאחר שנתיים עד 5 שנים בזמן הניתוח, למעט מקרה אחד מדגימת האימות החיצונית, שנאסף לפני הניתוח ואובחן על ידי היסטופתולוגיה. למעט ברונכיט כרונית. מקרי אדנוקרצינומה של הריאות נאספו לפני כריתת הריאות ואושרו על ידי אבחון פתולוגי. דגימות דם בצום נאספו במבחנות הפרדת סרום ללא נוגדי קרישה. דגימות הדם נקרשו במשך שעה בטמפרטורת החדר ולאחר מכן עברו צנטריפוגה ב-2851 × גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס לאיסוף נוזל סופרנטאנט בסרום. מנות סרום הוקפאו ב-80°C- עד לחילוץ מטבוליטים. המחלקה למניעת סרטן ובדיקה רפואית של מרכז הסרטן של אוניברסיטת סון יאט-סן אספה מאגר של סרום מ-100 תורמים בריאים, כולל מספר שווה של גברים ונשים בגילאי 40 עד 55. נפחים שווים מכל דגימת תורם עורבבו, המאגר שנוצר חולק ואוחסן ב-80°C-. תערובת הסרום שימשה כחומר ייחוס לבקרת איכות וסטנדרטיזציה של נתונים.
דגימות סרום ייחוס ודגימות בדיקה הופשרו ומטבוליטים חולצו בשיטת מיצוי משולבת (MTBE/מתנול/מים) 56. בקצרה, 50 מיקרוליטר של סרום עורבבו עם 225 מיקרוליטר של מתנול קר כקרח ו-750 מיקרוליטר של מתיל טרט-בוטיל אתר (MTBE) קר כקרח. ערבבו את התערובת ודגרו על קרח במשך שעה אחת. לאחר מכן עורבבו הדגימות ועורבבו בוורטקס עם 188 מיקרוליטר של מים בדרגת MS המכילים סטנדרטים פנימיים (13C-לקטט, 13C3-פירובט, 13C-מתיונין ו-13C6-איזולאוצין, שנרכשו ממעבדות האיזוטופים של קיימברידג'). לאחר מכן סרכזו את התערובת ב-15,000 × g למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס, והפאזה התחתונה הועברה לשתי מבחנות (125 מיקרוליטר כל אחת) לניתוח LC-MS במצבים חיוביים ושליליים. לבסוף, הדגימה אודה ליובש במתקן רכז ואקום במהירות גבוהה.
המטבוליטים היבשים שוחזרו ב-120 מיקרוליטר של 80% אצטוניטריל, עורבבו במשך 5 דקות, וצנטריפוגה ב-15,000 × g למשך 10 דקות ב-4°C. הסופרנטנטים הועברו לבקבוקוני זכוכית ענבריים עם מיקרו-תוספות למחקרי מטבולומיקה. ניתוח מטבולומיקה לא ממוקד על פלטפורמת כרומטוגרפיית נוזלים בעלת ביצועים גבוהים וספקטרומטריית מסה ברזולוציה גבוהה (UPLC-HRMS). המטבוליטים הופרדו באמצעות מערכת Dionex Ultimate 3000 UPLC ועמודת ACQUITY BEH Amide (2.1 × 100 מ"מ, 1.7 מיקרומטר, Waters). במצב יונים חיוביים, הפאזות הניידות היו 95% (A) ו-50% אצטוניטריל (B), כל אחת הכילה 10 מילימול/ליטר אמוניום אצטט ו-0.1% חומצה פורמית. במצב שלילי, פאזות ניידות A ו-B הכילו 95% ו-50% אצטוניטריל, בהתאמה, שתיהן הכילו 10 מילימול/ליטר אמוניום אצטט, pH = 9. תוכנית הגרדיאנט הייתה כדלקמן: 0-0.5 דקות, 2% B; 0.5-12 דקות, 2-50% B; 12-14 דקות, 50-98% B; 14-16 דקות, 98% B; 16-16.1 דקות, 98-2% B; 16.1-20 דקות, 2% B. העמודה נשמרה בטמפרטורה של 40°C והדגימה בטמפרטורה של 10°C בדוגם האוטומטי. קצב הזרימה היה 0.3 מ"ל/דקה, נפח ההזרקה היה 3 מיקרוליטר. ספקטרומטר מסות Q-Exactive Orbitrap (Thermo Fisher Scientific) עם מקור יינון אלקטרוספרייס (ESI) הופעל במצב סריקה מלאה וחובר למצב ניטור ddMS2 לאיסוף כמויות גדולות של נתונים. פרמטרי ה-MS נקבעו כדלקמן: מתח ריסוס +3.8 kV/- 3.2 kV, טמפרטורת קפילרית 320°C, גז מגן 40 arb, גז עזר 10 arb, טמפרטורת גוף חימום 350°C, טווח סריקה 70–1050 mcg/שעה, רזולוציה 70,000. הנתונים נאספו באמצעות Xcalibur 4.1 (Thermo Fisher Scientific).
כדי להעריך את איכות הנתונים, דגימות בקרת איכות (QC) מקובצות נוצרו על ידי הוצאת 10 מיקרוליטר של הנוזל העליון מכל דגימה. שש הזרקות של דגימות בקרת איכות נותחו בתחילת הרצף האנליטי כדי להעריך את יציבות מערכת UPLC-MS. דגימות בקרת איכות הוכנסו לאחר מכן מעת לעת למנה. כל 11 אצוות דגימות הסרום במחקר זה נותחו באמצעות LC-MS. מנות של תערובת סרום מ-100 תורמים בריאים שימשו כחומר ייחוס במנות המתאימות כדי לנטר את תהליך החילוץ ולהתאים את ההשפעות בין אצווה לאצווה. ניתוח מטבולומיקה לא ממוקד של קבוצת הגילוי, קבוצת התיקוף הפנימית וקבוצת התיקוף החיצונית בוצע במרכז המטבולומיקה של אוניברסיטת סון יאט-סן. המעבדה החיצונית של מרכז הניתוח והבדיקה של אוניברסיטת גואנגדונג לטכנולוגיה ניתחה גם 40 דגימות מהקבוצה החיצונית כדי לבחון את ביצועי מודל המסווג.
לאחר החילוץ והשיחזור, נמדדה כימות מוחלט של מטבוליטים בסרום באמצעות כרומטוגרפיית נוזלים בעלת ביצועים גבוהים במיוחד - ספקטרומטריית מסות טנדם (Agilent 6495 triple quadrupole) עם מקור יינון אלקטרוספרייס (ESI) במצב ניטור תגובות מרובה (MRM). עמודת ACQUITY BEH Amide (2.1 × 100 מ"מ, 1.7 מיקרומטר, Waters) שימשה להפרדת מטבוליטים. הפאזה הניידת הורכבה מ-90% (A) ו-5% אצטוניטריל (B) עם 10 mmol/L אמוניום אצטט ותמיסת 0.1% אמוניה. תוכנית הגרדיאנט הייתה כדלקמן: 0-1.5 דקות, 0% B; 1.5-6.5 דקות, 0-15% B; 6.5-8 דקות, 15% B; 8-8.5 דקות, 15%-0% B; 8.5-11.5 דקות, 0% B. העמודה נשמרה בטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס והדגימה בטמפרטורה של 10 מעלות צלזיוס בדוגם האוטומטי. קצב הזרימה היה 0.3 מ"ל/דקה ונפח ההזרקה היה 1 מיקרוליטר. פרמטרי MS נקבעו כדלקמן: מתח קפילרי ±3.5 קילו-וולט, לחץ אינבולייזר 35 psi, זרימת גז מעטפת 12 ליטר/דקה, טמפרטורת גז מעטפת 350 מעלות צלזיוס, טמפרטורת גז ייבוש 250 מעלות צלזיוס וזרימת גז ייבוש 14 ליטר/דקה. המרות ה-MRM של טריפטופן, פירובט, לקטט, היפוקסנטין וקסנטין היו 205.0–187.9, 87.0–43.4, 89.0–43.3, 135.0–92.3 ו-151.0–107.9 בהתאמה. הנתונים נאספו באמצעות Mass Hunter B.07.00 (Agilent Technologies). עבור דגימות סרום, טריפטופן, פירובט, לקטט, היפוקסנטין וקסנטין נמדדו כמותית באמצעות עקומות כיול של תמיסות תערובת סטנדרטיות. עבור דגימות תאים, תכולת הטריפטופן מנורמלת לתקן הפנימי ולמסת חלבון התא.
מיצוי שיא (m/z וזמן שמירה (RT)) בוצע באמצעות Compound Discovery 3.1 ו-TraceFinder 4.0 (Thermo Fisher Scientific). כדי לבטל הבדלים פוטנציאליים בין קבוצות, כל שיא אופייני של דגימת הבדיקה חולק בשיא האופייני של חומר הייחוס מאותו קבוצה כדי לקבל את השפע היחסי. סטיית התקן היחסית של הסטנדרטים הפנימיים לפני ואחרי הסטנדרטיזציה מוצגת בטבלה המשלימה 6. ההבדלים בין שתי הקבוצות אופיינו בשיעור גילוי שגוי (FDR <0.05, מבחן Wilcoxon signed rank) ושינוי קיפול (> 1.2 או <0.83). נתוני MS גולמיים של התכונות שחולצו ונתוני MS מתוקנים בסרום ייחוס מוצגים בנתונים משלימים 1 ובנתונים משלימים 2, בהתאמה. ביאור השיא בוצע על סמך ארבע רמות זיהוי מוגדרות, כולל מטבוליטים מזוהים, תרכובות עם ביאור משוער, סוגי תרכובות עם אפיון משוער ותרכובות לא ידועות 22. בהתבסס על חיפושים במסד נתונים ב-Compound Discovery 3.1 (mzCloud, HMDB, Chemspider), תרכובות ביולוגיות עם סטנדרטים מאומתים תואמים של MS/MS או הערות התאמה מדויקות ב-mzCloud (ציון > 85) או Chemspider נבחרו לבסוף כתרכובות ביניים בין המטבולומים הדיפרנציאליים. הערות שיא עבור כל מאפיין כלולות בנתונים המשלימים 3. MetaboAnalyst 5.0 שימש לניתוח חד-משתני של שפע מטבוליטים מנורמל-סכום. MetaboAnalyst 5.0 העריך גם ניתוח העשרת מסלול KEGG בהתבסס על מטבוליטים שונים באופן משמעותי. ניתוח רכיבים עיקריים (PCA) וניתוח ריבועים פחותים חלקיים דיסקרימיננטיים (PLS-DA) נותחו באמצעות חבילת התוכנה ropls (v.1.26.4) עם נורמליזציה של מחסנית וקנה מידה אוטומטי. מודל הסמן הביולוגי האופטימלי של מטבוליטים לחיזוי ממאירות של גושים נוצר באמצעות רגרסיה לוגיסטית בינארית עם הצטמקות מוחלטת מינימלית ואופרטור בחירה (LASSO, חבילת R v.4.1-3). ביצועי מודל ההבחנה בקבוצות הגילוי והאימות אופיינו על ידי הערכת AUC על סמך ניתוח ROC לפי חבילת pROC (גרסה 1.18.0). סף ההסתברות האופטימלי התקבל על סמך מדד יודן המקסימלי של המודל (רגישות + ספציפיות - 1). דגימות עם ערכים קטנים או גדולים מהסף ייחזו כגושים שפירים וכאדנוקרצינומה של הריאות, בהתאמה.
תאי A549 ‏(#CCL-185, American Type Culture Collection) גודלו במדיום F-12K המכיל 10% FBS. רצפי RNA קצרים מסוג hairpin ‏(shRNA) המכוונים ל-SLC7A5 וקבוצת בקרה שאינה מכוון ל-SLC7A5 (NC) הוכנסו לווקטור הלנטי-ויראלי pLKO.1-puro. רצפי האנטי-סנס של shSLC7A5 הם כדלקמן: Sh1 (5′-GGAGAAACCTGATGAACAGTT-3′), Sh2 (5′-GCCGTGGACTTCGGGAACTAT-3′). נוגדנים ל-SLC7A5 (#5347) וטובולין (#2148) נרכשו מ-Cell Signaling Technology. נוגדנים ל-SLC7A5 וטובולין שימשו בדילול של 1:1000 לניתוח Western blot.
מבחן הלחץ הגליקוליטי של Seahorse XF מודד את רמות החמצה חוץ-תאית (ECAR). במבחן, גלוקוז, אוליגומיצין A ו-2-DG ניתנו ברצף כדי לבדוק את קיבולת הגליקוליזציה התאית כפי שנמדדה על ידי ECAR.
תאי A549 שעברו טרנספקציה עם בקרה שאינה מכוונת (NC) ו-shSLC7A5 (Sh1, Sh2) צופו למשך הלילה בצלחות בקוטר 10 ס"מ. מטבוליטים של תאים חולצו עם 1 מ"ל של מתנול מימי קר כקרח בריכוז 80%. תאים בתמיסת המתנול נגרדו, נאספו למבחנה חדשה ועברו צנטריפוגה ב-15,000 × g למשך 15 דקות ב-4°C. אספו 800 מיקרוליטר של נוזל עליון וייבשו באמצעות מרכז ואקום במהירות גבוהה. לאחר מכן, כדורי המטבוליטים המיובשים נותחו לרמות טריפטופן באמצעות LC-MS/MS כמתואר לעיל. רמות NAD(H) תאיות בתאי A549 (NC ו-shSLC7A5) נמדדו באמצעות ערכת קולורימטריה כמותית NAD+/NADH (#K337, BioVision) בהתאם להוראות היצרן. רמות החלבון נמדדו עבור כל דגימה כדי לנרמל את כמות המטבוליטים.
לא נעשה שימוש בשיטות סטטיסטיות כדי לקבוע באופן ראשוני את גודל המדגם. מחקרי מטבולומיקה קודמים שמטרתם גילוי סמנים ביולוגיים15,18 נחשבו כמדדי ייחוס לקביעת גודל, ובהשוואה לדיווחים אלה, המדגם שלנו היה מספק. אף דגימה לא הוצאה מקבוצת המחקר. דגימות סרום חולקו באופן אקראי לקבוצת גילוי (306 מקרים, 74.6%) ולקבוצת אימות פנימית (104 מקרים, 25.4%) עבור מחקרי מטבולומיקה לא ממוקדים. כמו כן, בחרנו באופן אקראי 70 מקרים מכל קבוצה מקבוצת הגילוי עבור מחקרי מטבולומיקה ממוקדים. החוקרים היו עיוורים להקצאת קבוצות במהלך איסוף וניתוח נתונים LC-MS. ניתוחים סטטיסטיים של נתוני מטבולומיקה וניסויי תאים מתוארים בסעיפים תוצאות, מקרא איורים ושיטות. כימות טריפטופן תאי, NADT ופעילות גליקוליטית בוצע שלוש פעמים באופן בלתי תלוי עם תוצאות זהות.
למידע נוסף על עיצוב המחקר, עיינו בתקציר דוח תיק העבודות הטבעי המצורף למאמר זה.
נתוני ה-MS הגולמיים של התכונות שחולצו ונתוני ה-MS המנורמלים של סרום הייחוס מוצגים בנתונים משלימים 1 ובנתונים משלימים 2, בהתאמה. ביאורי שיא עבור תכונות דיפרנציאליות מוצגים בנתונים משלימים 3. ניתן להוריד את מערך הנתונים של LUAD TCGA מאתר https://portal.gdc.cancer.gov/. נתוני הקלט עבור שרטוט הגרף מסופקים בנתוני המקור. נתוני המקור מסופקים עבור מאמר זה.
קבוצת המחקר הלאומית לבדיקת ריאות, וכו'. הפחתת תמותה מסרטן ריאות באמצעות טומוגרפיה ממוחשבת במינון נמוך. צפון אנגליה. J. Med. 365, 395–409 (2011).
Kramer, BS, Berg, KD, Aberle, DR and Prophet, PC בדיקת סרטן ריאות באמצעות CT סלילי במינון נמוך: תוצאות ממחקר בדיקת הריאות הלאומי (NLST). J. Med. Screen 18, 109–111 (2011).
דה קונינג, ה.ג'. ואחרים. הפחתת תמותה מסרטן ריאות באמצעות בדיקת CT נפחית בניסוי אקראי. צפון אנגליה. J. Med. 382, ​​503–513 (2020).