CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) היא טכניקת עריכת גנום מדור שלישי אשר חוללה מהפכה בעולם הודות לתוצאות התפוקה הגבוהות שלה. היא שימשה לטיפול במחלות ביולוגיות וזיהומים שונים. חיידקים שונים ופרוקריוטים אחרים (כגון ארכאונים) כוללים גם מערכות CRISPR/Cas9 להגנה מפני פאג'ים. דווח כי אסטרטגיות מבוססות CRISPR/Cas9 יכולות לעכב את הצמיחה וההתקדמות של סרטן שד שלילי משולש (TNBC) על ידי מיקוד בגנים עמידים, שעתוק ורגולציה אפיגנטית שעשויים להיות בעלי שינויים. התערבויות טיפוליות אלו עשויות לסייע בטיפול בבעיות מאתגרות כגון עמידות לתרופות שנצפתה אפילו ב-TNBC. כיום, נעשה שימוש בשיטות שונות כדי להעביר CRISPR/Cas9 לתאי מטרה, כגון פיזיות (מיקרו-הזרקה, אלקטרופורציה ומצבים הידרודינמיים), ויראליות (וירוסים הקשורים לאדנו ולנטי-וירוס) ולא ויראליות (ליפוזומים וחלקיקי ננו-ליפידים). למרות שפותחו מודלים שונים לחקר הגורמים המולקולריים ל-TNBC, היעדר שיטות רגישות וממוקדות לאספקת כלי עריכת גנום in vivo מגביל את יישומן הקליני. לסיכום, סקירה זו בוחנת באופן מקיף את ההתקדמות, האתגרים, המגבלות והסיכויים של טיפול CRISPR/Cas9 עבור TNBC בהתבסס על ראיות קיימות. אנו מדגישים גם כיצד השילוב של בינה מלאכותית ולמידת מכונה יכול לשפר את אסטרטגיות CRISPR/Cas9 בטיפול ב-TNBC.
סרטן מאופיין בחלוקת תאים בלתי מבוקרת, שיבוש נקודות בקרה של מחזור התא ומוטציות בגנים מדכאי גידולים (TSGs) (Matthews et al., 2022). מבין סוגי הסרטן השונים, סרטן השד הוא סוג הסרטן הנפוץ ביותר בקרב נשים ובעל שיעור תמותה גבוה ברחבי העולם (Waks and Winer, 2019). סרטן השד הוא מחלה הטרוגנית בעלת מאפיינים מגוונים, כגון מאפיינים היסטולוגיים וביולוגיים, הצגה קלינית והתנהגות, ותגובה לטיפול (Weigelt et al., 2010). סיווג סרטן השד מספק תובנות מדויקות לאבחון סרטן השד ופרוגנוזה של גידול. השימוש בסמנים ביולוגיים נפוצים ומאפיינים קליני-פתולוגיים היה הקריטריון העיקרי לסיווג סרטן השד (Tsang and Tse, 2019). הפרוגנוזה והתגובה לטיפול בסרטן השד מושפעות מגורמים רבים, כולל נוכחות של קולטן אסטרוגן (ER), קולטן פרוגסטרון (PR), קולטן גורם גדילה אפידרמלי אנושי 2 (HER2/neu), ודרגה היסטולוגית, סוג הגידול ודרגתו. גודל וגרורות בבלוטות הלימפה (Al-Tubaiti, 2020). זוהו חמישה תת-סוגים מולקולריים פנימיים של סרטן השד, כולל לומינל A, לומינל B, מועשר ב-HER2, דמוי בזאל וקלודין-נמוך (Prat et al., 2015). TNBC הוא תת-סוג מולקולרי של סרטן שאינו מבטא את כל ER, PR ו-HER2 (Yin et al., 2020). מאפיינים פתולוגיים אלה קשורים ל-TNBC, מה שמאשר את התקדמותו המהירה ואת אופיו האגרסיבי יותר מכל סוג אחר של סרטן השד (Feng et al., 2018). בנוסף, Peru et al (2000) השתמשו בטכנולוגיית microarray כדי לסווג מחדש את סרטן השד ולזהות חמישה תת-סוגים פנימיים של סרטן השד (Cadenas, 2012). סרטן שד דמוי בזאל הוא תת-סוג של סרטן השד בעל פנוטיפ שלילי-טריפל וקשור להתקדמות מהירה. יש לציין כי כל מקרי סרטן השד דמוי-הבסיס מאובחנים בדרך כלל בטעות כ-TNBC, אך רק 77% מהם הם TNBC; לעומת זאת, 71-91% מסרטני השד דמויי-הבסיס הם דמויי-בסיס, דבר המצביע על כך ששני סוגי סרטן השד הללו חופפים ומייצגים סיווגים שונים (Wang D.-Y. et al., 2019). עובדה זו יוצרת צורך לאפיין את ההטרוגניות של TNBC כדי להבהיר את הפרוגנוזה ולזהות תגובות פוטנציאליות לטיפולים נוכחיים ועתידיים. בנוסף, TNBC מהווה 15-20% מכלל מקרי סרטן השד והוא שכיח יותר בקרב נשים מתחת לגיל 50. מוטציות BRCA1 או BRCA2 דווחו בכ-20% ממקרי TNBC (Xie et al., 2017; Tzikas et al., 2017, 2020). מחקרים הראו גם כי ל-TNBC יש סביבה חיסונית ייחודית הכוללת רמות גבוהות של גורמי גדילה של האנדותל בכלי הדם, מקרופאגים הקשורים לגידול (TAMs), לימפוציטים מסתננים לגידול (TILs) ומולקולות אחרות המעורבות בגדילת גידולים ונדידתם. לכן, הבנת המיקרו-סביבה של TNBC היא קריטית לפרוגנוזה ולטיפול בה (Fan and He, 2022).
כדי להעריך את הפרוגנוזה של TNBC ולהבטיח טיפול יעיל, חשוב לבצע אבחון מדויק, המבוסס בעיקר על אימונוהיסטוכימיה (IHC) לגילוי ER, PR ו-HER2, וממוגרפיה לגילוי גידולים בשד. עם זאת, ממוגרפיה אינה יכולה לתאר כראוי מאפיינים תוך-גידוליים כגון נמק ופיברוזיס (Deepak Singh et al., 2021). מאחר ופרוגנוזה ואבחון ירודים מונעים מרופאים לרשום את התרופות הנכונות (Chaudhary, 2020), נעשה שימוש באסטרטגיות שונות לשיפור הטיפול בחולים עם TNBC. כיום, שתי תרופות, דוקסורוביצין וציקלופוספמיד, משמשות בחולים עם TNBC והראו תוצאות טובות. בנוסף, נעשה שימוש בתרופות פלטינה אחרות, כגון קרבופלטין וציספלטין (Sikov et al., 2015). בנוסף, מעכבי PARP כגון אולאפריב, ולפאריב ו-PF-01367338 שימשו כתרופות כימותרפיות פוטנציאליות לטיפול ב-TNBC (Ishino et al., 2018). מאחר שדווח כי מסלולי האיתות Wnt/b-Catenin, NOTCH ו-Hedgehog מעורבים בהופעה ובהתקדמות של TNBC, כיוון תרופות למסלולים אלה עשוי להיות אסטרטגיה חשובה (Aysola et al., 2013). למרות שניתוח, הקרנות וכימותרפיה נותרו עמוד התווך של הטיפול ב-TNBC כיום, חלה התקדמות משמעותית בפיתוח טיפולים חדשים, כולל טיפול ממוקד, אימונותרפיה, כלי עריכה גנים שונים הקשורים ל-CRISPR כגון Cas9n, dCas9, CRISPR/Cas12, עריכה ראשונית, וריפוי גנים ממוקד CRISPR/Cas9. כאן נתמקד בכלי עריכה גנים שונים הקשורים ל-CRISPR המשמשים בטיפול ב-TNBC. ביניהם, CRISPR/Cas9 זכה לתשומת לב נרחבת.
Cas9n, הידוע גם בשם Cas9 nickase, הוא גרסה מהונדסת גנטית של חלבון Cas9 שמקורה במערכת עריכת הגנום CRISPR/Cas9 (Gupta et al., 2019). בצורתו המקורית, חלבון Cas9 מכיל שני דומייני נוקלאז: RuvC ו-HNH, שתפקידם העיקרי הוא ביקוע שני גדילי ה-DNA. עם זאת, ב-Cas9n, אחד מתחומי הנוקלאז, HNH, עובר מוטציה גנטית והופך ללא פעיל. לכן, דומיין ה-HNH של Cas9n נותר לא מתפקד. רק דומיין RuvC נותר פעיל, מה שמאפשר ל-Cas9n לחתוך או ליצור שברים על גדילי DNA בודדים (Trevino and Zhang, 2014). בהשוואה ל-Cas9, Cas9n יכול להפחית ביעילות השפעות מחוץ למטרה ולשפר במדויק מנגנוני תיקון תאים. ניתן להשתמש ב-Cas9n כדי לפתור בעיות שונות, כגון יצירת שברים במיקומים ספציפיים ב-DNA דו-גדילי. למטרה זו, שתי מולקולות Cas9n שולבו ונעשה בהן שימוש יחד (Yee, 2016). קינאז מעורב לינארית 3 (MLK3) הוא חלבון קינאז המופעל על ידי מיטוגן המשמש כווסת מפתח במהלך גרורות ב-TNBC (Cronan et al., 2012).
MLK3 יכול להפעיל מסלולי איתות מרובים המובילים לגרורות ב-TNBC. לדוגמה, מסלול c-Jun N-terminal kinase (JNK) מווסת את תנועתיות התאים ואת פירוק המטריצה החוץ-תאית, ו-MLK3 מפעיל את מסלול JNK, ובכך משפר את תנועתיות התא ומעניק תכונות פולשניות (Rattanasinchai and Gallo, 2016). MLK3 מווסת גם EMT. לשם כך, הוא מפעיל גורמי שעתוק במורד הזרם כמו Snail, Slug ו-Twist. גורמים אלה מעכבים את הביטוי של סמני אפיתל ומקדמים את הביטוי של סמנים מזנכימליים, מה שמוביל לרכישת פנוטיפ גרורתי (Casalino et al., 2023). MLK3 נצפה כממלא תפקיד בעיצוב מחדש של תאי גידול תאי (ECM) ובהפעלה של פרוטאזות כמו מטאלופרוטאינאזות מטריקס (MMPs) המפרקות את ה-ECM. זה מקל על פלישת תאי גידול והתפשטות לאתרים מרוחקים (Katari et al., 2019). לפיכך, מחקרים קודמים הראו כי MLK3 ממלא תפקיד קריטי ב-TNBC. רטנסינצ'אי וגאלו השתמשו במודלים של TNBC כדי לחקור את תפקידו של MLK3 ומצאו שהוא מקדם התפתחות סרטן דרך מסלולי איתות ספציפיים. הם השתמשו ב-CRISPR/Cas9n כדי לערוך MLK3 וצפו בירידה משמעותית בגרורות TNBC (רטנסינצ'אי וגאלו, 2016).
dCas9, המכונה לעתים קרובות Cas9 לא פעיל, הוא נגזרת שעברה שינוי של חלבון Cas9. שלא כמו Cas9 פעיל, ל-dCas9 חסר פעילות אנדונוקלאז, מה שהופך אותו ללא מסוגל לגרום לשברים כפולים של גדיל ה-DNA. לכן, ניתן להשתמש ב-dCas9 כדי למקד במדויק אזורים ספציפיים בגנום ללא כל שינוי או התאמה ברצף ה-DNA (Wang et al., 2016). ב-dCas9, שני חלבוני אנדונוקלאז, RuvC ו-HNH, מושבתים על ידי דיכוי שיירי חומצות אמינו חשובות. (Richter et al., 2016). למרות היעדר פעילות ביקוע DNA, dCas9 ממלא מספר תפקידים חשובים במחקר גנטי וביוטכנולוגיה. לדוגמה, הוא מאפשר ויזואליזציה של אזורים ספציפיים בגנום, מקל על ויסות תעתוק ומקדם שינויים אפיגנטיים (Brocken et al., 2018).
גורם התעתוק ZEB1 (Zinc finger E-box binding homeobox 1) ממלא תפקיד ספציפי וקריטי בתיווך המעבר אפיתל-מזנכימלי (EMT), תהליך תאי המתרחש במהלך התפתחות עוברית, תיקון רקמות והתקדמות סרטן. הוא כרוך בהפיכת תאי אפיתל לתאים מזנכימליים, וכתוצאה מכך שינויים במורפולוגיה של התא, תנועתיות, פולשנות וכו' (Wu et al., 2020). ZEB1 מעכב סמנים אפיתליאליים מרובים, כגון E-cadherin ו-Occludin, האחראים לשמירה על הידבקות תא-תא וקוטביות של תאי אפיתל ב-TNBC (Moreno-Bueno et al., 2008). בנוסף, ZEB1 מפעיל סמנים מסוימים כגון N-cadherin, vimentin ופיברונקטין (Konradi et al., 2014) וגם מווסת גנים המעורבים בעיצוב מחדש של השלד התא כגון Rho GTPases ו-matrix metalloproteinases (MMPs) (Huang). et al., 2014). 2022), בנוסף, הוא משפיע גם על מסלולי איתות שונים כגון transforming growth factor-β (TGF-β), איתות Wnt וכו', ובכך מקדם פלישה של גידולים וגרורות ב-TNBC (Chen et al., 2016). מחקרים רבים ועדויות מדעיות מצביעים על כך של-ZEB1 פוטנציאל גדול כגורם בעל ערך לגילוי והתערבות טיפולית של TNBC. במחקר שנערך לאחרונה, Waryah et al. השתמשו במודל TNBC והשיגו דיכוי מוחלט של ZEB1 על ידי dCas9. לפיכך, הם הבחינו בספציפיות גבוהה מאוד ובעיכוב כמעט מוחלט של ZEB1 בתנאי in vivo (Waryah et al., 2023).
CRISPR/Cas12 הוא כלי עריכת גנים בשם CRISPR/Cpf1. הוא נגזר ממערכת CRISPR/Cas, כאשר המונח Cas12 מתייחס לחלבון 12 הקשור ל-CRISPR (Bharathkumar et al., 2022), הדומה לחלוטין ל-Cas9. ההבדל היחיד הוא שהוא מכיל את חלבון Cas12. בהשוואה ל-Cas9, ל-Cas12 יש כמה פונקציות ייחודיות כגון יצירת קצוות דביקים במהלך תהליך עריכת הגנים, בעוד ש-Cas9 מייצר קצוות קהים (Wang et al., 2021). תכונה זו של Cas12 תורמת לטכנולוגיית מניפולציית ה-DNA הספציפית שלו. כחלבון המסוגל לזהות ולחתוך במדויק את ה-DNA של המטרה, יש לו רב-תכליתיות יוצאת דופן, מה שהופך אותו לכלי יעיל למגוון יישומים, כולל עריכת גנים (Pickar-Oliver and Gersbach, 2019).
בדומה לווריאנטים אחרים של CRISPR, CRISPR/Cas12 מסוגל גם לחסל או להפעיל גנים ב-TNBC, ולמקד גנים אשר ממלאים תפקיד חשוב בפתוגנזה שלו או בתגובה לטיפול (Yang and Zhang, 2023). כדי להשיג תהליך זה, פותח RNA מנחה (gRNA) המכוון את Cas12 לגן המטרה. לאחר ש-Cas12 נקשר למטרה שלו, הוא יוצר שברים כפולים ב-DNA ומפעיל מנגנוני תיקון DNA. במהלך תהליך התיקון, נוקלאוטידים שגויים עשויים להשתלב, מה שמוביל למוטציות גנטיות ולאובדן תפקוד (Zhang et al., 2021a). בנוסף, גרסה משופרת של האנזים Cas12 (הנקרא dCas12) שימשה גם היא להפעלת גנים. על ידי שילובו עם מפעיל שעתוק, ניתן לגרום לגנים מסוימים, ובכך להפעיל אותם. לטכנולוגיה זו פוטנציאל גדול בקידום הפעלת גנים מדכאי גידולים (Sultan et al., 2022).
עריכה ראשונית היא טכנולוגיית עריכת גנום חדשה ומתקדמת ביותר. היא מסוגלת לשנות את ה-DNA של אורגניזם בצורה מדויקת מאוד (Chen and Liu, 2023). עריכה ראשונית מושגת באמצעות שילוב של שני מרכיבים עיקריים: אנזים CRISPR/Cas9 שעבר שינוי וטרנסקריפטאז הפוך. תפקידו של האנזים CRISPR/Cas9 הוא למקד באופן סלקטיבי אתרים מדויקים בגנום, בעוד שטרנסקריפטאז הפוך מסייע לשנות באופן יסודי את ה-DNA במיקום המטרה (Hassan et al., 2021). במנגנון עריכת הפריימרים, השלב הראשון כרוך ביצירת RNA מדריך לעריכת פריימרים (pegRNA) (Standage-Beier et al., 2021). הוא מכיל את רצף המטרה ותבנית ה-RNA התואמים לאתר העריכה הרצוי ב-DNA המטרה. לאחר מכן, ה-pegRNA מוחדר לתאי המטרה יחד עם נוקלאז עריכת פריימרים (PE2). PE2 הוא חלבון היתוך המורכב מאנזים Cas9, טרנסקריפטאז הפוך ומתאם לעריכת פריימרים (Martín-Alonso et al., 2021). בתוך התא, קומפלקסים של pegRNA ו-PE2 מחפשים את ה-DNA הספציפי שהם רוצים לשנות. האנזים Cas9 חותך את ה-DNA ויוצר תבנית המורכבת מגדילים בודדים (Choi et al., 2022). רוורס טרנסקריפטאז משתמש בתבנית זו כדי להכין את ה-DNA לעריכה. יחד עם העתקת ה-DNA, כלולות גם הוראות לעריכת תבנית ה-RNA. לבסוף, גדיל ה-DNA החדש שנוצר משמש כתבנית לתיקון השבר ב-DNA, וכתוצאה מכך נוצר רצף DNA שונה המכיל את השינוי הרצוי (Ochoa-Sanchez et al., 2021). מנגנוני עריכת פריימרים יכולים להוביל למוטציות נרחבות בגנים. הם יכולים לכוון למוטציות נקודתיות, הוספות, מחיקות ואפילו החלפות גנים (Anzalone et al., 2019; Chen and Liu, 2023). עריכת פריימרים מציעה מספר יתרונות על פני טכנולוגיות עריכת גנום קודמות. אלה כוללים דיוק מוגבר, הפחתת השפעות מחוץ למטרה ויכולת לערוך DNA מבלי להסתמך על שברים כפולים של גדילי DNA (Anzalone et al., 2020).
טכנולוגיית CRISPR/Cas9 פותחה במקור כדי להגן על חיידקים מפני העברת פלסמידים וזיהום פאג'ים, ומאוחר יותר שימשה ככלי יעיל למיקוד DNA מבוסס RNA לעריכת גנום (Jiang and Doudna, 2017). בנוסף, דווח כי מערכת CRISPR/Cas9 קיימת ב-50% וב-87% מהגנומים החיידקיים והארכאליים, בהתאמה (Ishino et al., 2018). CRISPR/Cas9 הוא כלי פוטנציאלי למחיקה, הכנסה ותיקון של כל רצף גנטי חריג באמצעות מצבי in vivo ו-in vitro (Sabit et al., 2021). יתר על כן, CRISPR/Cas9 הוכח כחלק ממערכת החיסון האדפטיבית בשל הספציפיות שלו לגנים המעניינים (Chen and Zhang, 2018).
CRISPR/Cas9 מורכב מ-Cas9 ומ-RNA מנחה יחיד (sgRNA). Cas9 הוא אנדונוקלאז המורכב ממספר רכיבי חלבון. בנוסף, ל-Cas9 תכונות מבניות וקונפורמציה ייחודיות (Pacesa et al., 2022) מכיוון שהוא מורכב משתי אונות: זיהוי (REC) ונוקלאז (NUC). אונת ה-REC מחולקת עוד לשלושה אזורים: REC1, REC2 וסלילי גשר (Cromwell et al., 2018). ה-NUC מורכב משלוש אונות, שהן RuvC (RuvC I, RuvC II, RuvC III), HNH ותחום האינטראקציה של המוטיב הסמוך לפרוטוספייסר (PAM) (איור 1) (Song et al., 2016). sgRNA מורכב משני רכיבים, כולל CRISPR RNA (crRNA) ו-RNA קטן המקודד טרנספורמציה (TRACER RNA) (איור 1). ה-sgRNA מחבר את חלבון Cas9 לקונקסינים ליצירת קומפלקס פעיל, המכונה גם קומפלקס אפקטור (Richter et al., 2012). crRNA הוא זוג בסיסים בן 18-20 נוקלאוטידים הממלא תפקיד קריטי בזיהוי רצפי DNA של המטרה. בנוסף, crRNA מתחם ל-DNA של המטרה, ו-tracrRNA משמש כבסיס עבור נוקלאז Cas9 כדי להיקשר ל-DNA המטרה (Manghwar et al., 2019). מצד שני, רצף PAM מכיל 3 נוקלאוטידים, מה שמאשר, מגדיר ומתווך את הקישור של קומפלקס האפקטור ל-DNA. תת-היחידות RuvC ו-HNH של קומפלקס חלבון Cas9 הן בעלות פעילות קטליטית (Richter et al., 2012; Asmamaw and Zawdie, 2021). תחום נוקלאז HNH של תת-היחידה Cas9 חותך את גדיל ה-DNA הקשור ל-crRNA. תחום הנוקלאז RuvC שובר גדילי DNA אחרים ויוצר שבורים כפולים (DSBs), שלאחריהם מופעלים שני מנגנוני תיקון שונים של שבירת DNA (Jiang and Doudna, 2017) (איור 1).
איור 1. סקירה כללית של CRISPR/Cas9 (א). רכיבי מערכת CRISPR/Cas9: (i). אנדונוקלאז Cas9 אחראי על חיתוך רצף ה-DNA של המטרה, (ii) RNA מנחה יחיד (sg) הנובע מהיתוך של כימרות crRNA ו-tra-crRNA. (שתיים). Cas9 כולל מספר רכיבים כגון Rec I, Rec II, אונת NUC (HNH ו-Ruv C הם תת-רכיבים) ותחום האינטראקציה PAM (C) עם פונקציות תואמות. קומפלקס החלבון CRISPR/Cas9 מפרק רצפי DNA לצורות לא משלימות ומשלימות (D). CRISPR/Cas9 עורך את הגנום בשלושה שלבים: זיהוי, חיתוך ותיקון. ה-sg-RNA שתוכנן מנחה את Cas9 ומזהה את הרצף הרצוי באמצעות הרכיב המשלים crRNA. Cas9 מזהה את רצף ה-PAM ב-5′-NGG-3′ וממיס את ה-DNA, יוצר היבריד DNA-RNA ומפעיל את הביקוע. תחום ה-HNH של Cas9 חותך את הגדיל המשלים, ודומיין RuvC חותך את הגדיל הלא משלים. CRISPR/Cas9 מתקן DNA דו-גדילי על ידי שבירתו בשתי דרכים: חיבור קצוות לא הומולוגי (NHEJ) ותיקון מכוון הומולוגיה (HDR). NHEJ מתקן DNA דו-גדילי בהיעדר DNA הומולוגי זר באמצעות תהליך אנזימטי, מנגנון מועד לטעויות שיכול להכניס או להסיר רצפי DNA אקראיים. HDR הוא ספציפי מאוד ודורש תבניות DNA הומולוגיות.
מסלולי תיקון בתיווך CRISPR/Cas9 כוללים מנגנוני חיבור קצה לא הומולוגיים (NHEJ) ותיקון מכוון הומולוגיה (HDR). NHEJ הוא מסלול מועד לטעויות מכיוון שהוא כרוך בהחדרה או מחיקה ואינו דורש דפוס כלשהו במהלך מנגנון התיקון. הוא משתמש בנוקלאוטידים אקראיים כדי לייצר חלבונים סטנדרטיים (Abbasi et al., 2021). מערכת תיקון זו מורכבת מארבעה קומפלקסים כגון קומפלקס KU, קומפלקס חלבון משלים צולב מסוג 4 (XRCC-4), אנזים עיבוד קצה ה-DNA, ו-protein kinase DNA-PKcs (Abbasi et al., 2021). לחלבון הקומפלקס KU שתי תת-יחידות, Ku 70 ו-Ku 80, והוא ממלא תפקיד חשוב במנגנון ה-NHEJ, מכיוון שמנגנון התיקון מתחיל על ידי קשירה של שתי תת-יחידות (Ku 70 ו-Ku 80) לקצוות הקהים או הכמעט קהים של ה-DNA המטרה (Abbasi et al., 2021), ומשמשים כפיגום לגיוס גורמים אחרים הקשורים ל-NHEJ לאתר הפגיעה (Yang et al., 2020). XRCC-4 ו-DNA ליגאז מורכבים מ-334 ו-911 חומצות אמינו, בהתאמה, וקומפלקס ה-XRCC4-DNA ליגאז IV מגרה קשירת קצוות ה-DNA (Chatterjee et al., 2015). אנזים עיבוד קצה DNA, המכונה גם פולינוקלאוטיד קינאז 3'-פוספט, הוא אנזים עיבוד קצה DNA. הוא יכול להסיר את קבוצת 3'P ב-DNA ולזרחן את קבוצת 5'OH במהלך תיקון DSB. זה כרוך גם בתיקון של שבורים חד-גדיליים (SSBs) באמצעות מסלול תיקון SSB (Chatterjee et al., 2015). חלבון קינאז DNA-PKcs הוא חלבון קינאז תלוי-DNA המורכב מתת-יחידה קטליטית של משפחת PIKKs (קינאזות קשורות לפוספטידילונוזיטול 3-קינאז) ומשפחת המוטציות אטקסיה טלנגיאקטאזיה (ATM), כמו גם ATRs הקשורים ל-ATM ו-Rad3, שבורים חד-גדיליים (DSBs) ושברים חד-גדיליים (Yue et al., 2020; Peng et al., 2016).
HDR הוא מנגנון תיקון מדויק ומתאים יותר משום שהמידע מועתק באמצעות הצורה השלמה של דופלקס ה-DNA ההומולוגי, למרות שהוא דורש נוכחות של כרומטידות אחיות. זה קורה במהלך שלב S/G2 של מחזור התא של יונקים. HDR מתרחש בעיקר במיני שמרים, אך NHEJ הוא קריטי אצל יונקים (Burma et al., 2006; Abbasi et al., 2021). מנגנון התיקון המלא מוצג באיור 1.
מאחר ש-TNBC נגרם כתוצאה מחריגות גנטיות ואפיגנטיות, תיקון של חריגות גנומיות/אפיגנומיות ממאירות באמצעות CRISPR/Cas9 עשוי להיות גישה טיפולית סבירה (Chen et al., 2019). בנוסף, חלק מגורמי התעתוק המעורבים בוויסות שעתוק ספציפי לתא עשויים להפגין מאפיינים ייחודיים של תאי סרטן, דבר המצביע על כך שוויסות שעתוק עשוי להיות גישה מצוינת לטיפול בסרטן (Drost et al., 2017). ניצול מאפיינים מולקולריים אלה של גידולים, כגון פגמים גנטיים, אפיגנטיים ותעתוקיים, לפיתוח תרופות יכול לשפר את התוצאות הקליניות ולהפחית את עלויות הסינון. CRISPR הוא כלי פוטנציאלי לעריכת גנים שיכול לא רק לזהות ולזהות מטרות גנומיות הגורמות לסרטן, אלא יכול לשמש גם לעריכה, דיכוי ושינוי אפיגנטי של אונקוגנים בתאים אנושיים (טבלה 1) (Ahmed et al., 2021). מספר בדיקות CRISPR נערכו כדי לחפש גנים הקשורים למדכאי גידולים, אונקוגנים ועמידות לתרופות. השימוש ב-CRISPR/Cas9 לעריכת אונקוגנים שונים של TNBC מוצג באיור 2.
איור 2. עריכת גנים של אונקוגנים שונים של TNBC באמצעות CRISPR/Cas9, וכתוצאה מכך ירידה בגדילת הגידול ויצירת גרורות. אונקוגנים אלה כוללים את CDK7, NAT1, UBR5, YTHDF2, ITGA9, CXCR4 ו-CXCR7, Crypto1, ROR1 ו-ST8SIA, המעורבים בהופעה וביצירת גרורות של TNBC.
נדידת תאי גזע סרטניים, פלישה ומעבר אפיתל-מזנכימלי (EMT) קשורים ל-ITGA9. מחקרים קודמים הראו כי ITGA9 הוא שחקן מפתח במסלול Notch וממלא תפקיד מעניין בגרורות של רבדומיוסרקומה (Molist et al., 2020). בנוסף, נמצא כי ITGA9 קשור קשר הדוק לפרוגנוזה של חולים במספר סוגי גידולים, כולל סרטן השד (Wang Z. et al., 2019). בנוסף, ניתוח ביואינפורמטיקה של ITGA9 הראה כי הביטוי שלו ב-TNBC היה גבוה משמעותית מאשר בתת-סוגים אחרים של סרטן השד. רמות גבוהות של ITGA9 קשורות לגרורות בגידול ולהישנות בחולות TNBC. נוקאאוט של ITGA9 על ידי CRISPR/Cas9 הביא לתכונות דמויות תאי גזע סרטניים (CSC), אנגיוגנזה של הגידול, צמיחת הגידול והפחתת גרורות על ידי קידום פירוק β-catenin ב-TNBC (Wang Z. et al., 2019).
קריפטו-1 הוא בן למשפחת TGF-β והוא קריטי להתפתחות מוקדמת של תאי גזע, תחזוקת תאי גזע וגרורות סרטניות (Ishii et al., 2021). ידוע גם בשם Tdgf-1, זהו חלבון איתות אונקוגני מעוגן GPI המעורב בוויסות היווצרות הפס הפרימיטיבי, המזודרם והאנדודרם, כמו גם ביצירת אסימטריה שמאלה/ימינה בהתפתחות איברי הגוף במהלך האמבריוגנזה (Zhang et al., 2021b). בנוסף, הוכח כי קריפטו-1 מעורב במעבר אפיתל-מזנכימלי (EMT) כסמן של תאי גזע (Zhang et al., 2021b). EMT קריטי לא רק לתהליכים שונים כגון התפתחות עוברית, פיברוזיס וריפוי פצעים, אלא גם לפלישה וגרורות סרטניות. בנוסף, הוכח כי קריפטו-1 מקיים אינטראקציה עם ארבעה קולטני Notch ומשפר את התבגרותם לאחר התרגום (Brandstadter and Maillard, 2019). ידוע כי מסלול האיתות Notch מעורב בתחזוקת תאי סרטן השד האנושיים. מחקרים הראו כי נוקאאוט של Crypto-1 בתיווך CRISPR/Cas9 מדכא צמיחה וגרורות של הסרטן. לכן, Crypto-1 עשוי להפוך למטרה טיפולית חשובה עבור TNBC (Castro et al., 2015).
חלבון XCL12 וקולטן הכימוקינים שלו CXC (CXCR4 ו-CXCR7) ממלאים תפקידים שונים בהתפשטות, גדילה, נדידה ופלישה של תאי סרטן (Wu et al., 2015). כימורצפטורים אלה נקשרו להתפתחות של TNBC דרך מסלולי איתות מרובים הן במודלים in vivo והן במודלים in vitro (Wu et al., 2015). בנוסף, הפעלת CXCR4 ו-CXCR7 קשורה לרגישות גבוהה יותר לגרורות ופרוגנוזה גרועה ב-TNBC (Karn et al., 2022). לכן, נוקאאוט של CXCR4 ו-CXCR7 עשוי להפוך לגנים יעילים לטיפול בסרטן השד, כולל TNBC. מחקר של Yang et al. Yang et al. (2019) השתמשו ב-CRISPR/Cas9 כדי לבטל יחד את הגנים CXCR4 ו-CXCR7 ומצאו כי התפשטות, גדילה, נדידה ופלישה של TNBC מעוכבים באופן משמעותי (Yang et al., 2019).
רמות מוגברות של miR-3662, אונקוגן של TNBC, נצפו ברקמות סרטן השד (Yi et al., 2022). הוכח כי הפחתה של miR-3662 מעכבת גדילה וגרורות של גידולי סרטן השד הן in vivo והן in vitro (Agarwal and Gupta, 2021). HBP-1 הוא מעכב חזק של איתות Wnt/-catenin וסביר להניח שהוא אחראי לגדילה של תאי TNBC בתיווך miR-3662. לאחרונה, Yi et al. מצאו כי ציר miR-3662-HBP1 מווסת את מסלול האיתות Wnt/-catenin בתאי TNBC (Yi et al., 2022). בשל הביטוי הספציפי לגידול, miR-3662 עשוי להיות מטרה טיפולית פוטנציאלית עבור TNBC. לכן, הפחתה של miR-3662 בתיווך CRISPR/Cas9 עשויה להיות גישה מצוינת לפיתוח תרופות חדשות לטיפול ב-TNBC.
UBR5 הוא נוקלאופוספופרוטאין במשקל 300 kDa שזוהה כווסת מפתח של יצירת גידולים, גרורות ותגובה חיסונית בסוגי סרטן שונים (Shearer et al., 2015; Fu et al., 2023). דווח כי UBR5 מווסת בצורה משמעותית כלפי מעלה בדגימות TNBC ומעודד את תפקוד ERα על ידי גרימת התפשטות באמצעות פעילות יוביקוויטין ליגאז שלו (Bolt et al., 2015). מחקרי ריצוף אקסומים מלאים של דגימות TNBC ראשוניות הראו גם ביטוי מוגבר של UBR5, דבר המצביע על תפקידו בהתפתחות TNBC. בנוסף, מחיקה של UBR5 המונעת על ידי CRISPR/Cas9 הראתה עיכוב משמעותי של גרורות וצמיחה של TNBC במודלים ניסיוניים של עכברים. יתר על כן, הכללת UBR5 במודל עכבר מסוג בר החזירה את מלוא הפונקציונליות שלו, בעוד שהשפעה זו לא נצפתה בזני מוטציה מומתים (Liao et al., 2017). חוסר ב-UBR5 קשור לאפופטוזיס מוגבר, נמק ועיכוב צמיחת גידול ב-TNBC עקב אנגיוגנזה לקויה. עקב אובדן UBR5, התפשטות הגידול לאיברים מרוחקים מצטמצמת, ו-UBR5 גורם לתסמונת אלקטרומגנטית (EMT) לא תקינה בעיקר על ידי הפחתת ביטוי E-cadherin (Zhang and Weinberg, 2018). לאחרונה, UBR5 הוכח כגורם חשוב מאוד בתעתוק PDL1 המושרה על ידי IFN-γ ב-TNBC עקב היעדר פעילות יוביקוויטינציה של E3. ניתוח טרנסקריפטום RNA גילה כי ל-UBR5 עשויות להיות השפעות מערכתיות על גנים הקשורים למסלול IFN-γ ולקדם טרנסאקטיבציה של PDL1 על ידי הגברת רמות ההפעלה של RNA חלבון קינאז (PKR) ומתמרי האות והמפעילים שלו, transcript 1 (STAT1) וגורם מווסת אינטרפרון 1 (IRF1). עם זאת, אבלציה משולבת של ביטוי UBR5 ו-PD-L1 בתיווך CRISPR/Cas9 בעלת אפקט טיפולי סינרגטי יותר מאשר כל חסימה בנפרד, עם השפעות עמוקות על המיקרו-סביבה של הגידול (Wu et al., 2022). לפיכך, CRISPR/Cas9 עשוי להיות כלי חשוב לעיכוב תפקוד UBR5, ובכך לדכא גרורות של תאי TNBC וצמיחת הגידול.
ROR1 הוא חלבון טרנסממברני מסוג I המתבטא במהלך סרטן והתפתחות עוברית וזוהה כחלבון אונקופטלי (Nicholas Borcherding, 2014). ההתנהגות הפולשנית של סוגי סרטן שונים בבני אדם קשורה לעלייה ברמת ROR1. תוצאות מבטיחות התקבלו ממחקרים in vivo ו-in vitro שכללו תרכובות טיפוליות המכוונות ל-ROR1 (Chien et al., 2016). רמות גבוהות של mRNA של ROR1 בביופסיות של רקמת השד נקשרו גם לגידולי שד דמויי בסיס (BL) אגרסיביים ולנדידתם לחלקים אחרים בגוף. יתר על כן, ביטוי יתר של ROR1 זוהה כסמן פרוגנוסטי להתפתחות TNBC (Chien et al., 2016). עם זאת, השתקת ROR1 באמצעות CRISPR/Cas9 כדי לדכא צמיחה וגרורות של TNBC תהיה אסטרטגיה יעילה.
תהליך הסיאלילציה כרוך בהוספת חומצה סיאלית לגליקוקונג'וגטים, המזורזת על ידי סיאלילטרנספראזות (STs). ST8SIA1 שייך למשפחת ST וממלא תפקיד חשוב בפתוגנזה של מחלות שונות כגון לוקמיה לימפוציטית וסרטן המעי הגס (Chang et al., 2018). ניתוח רצף RNA מראה ש-ST8SIA1 מתבטא מאוד ברקמת השד של חולות TNBC והוא מתואם באופן חיובי עם מוטציות בגן מדכא הגידול p53, אשר עשוי לתרום לפתוגנזה של TNBC (Battula et al., 2017). בנוסף, ST8SIA1 מעורב בגרורות ובהישנות של TNBC, דבר המצביע על כך שהוא ממלא תפקיד חשוב בהופעה ובהתפתחות של TNBC. במודל חוץ גופי של TNBC, הוכח כי הפחתת ST8SIA1 על ידי CRIPSR/Cas9 חוסמת צמיחה וגרורות (Battula et al., 2017). ממצא זה מצביע על כך ש-CRISPR/Cas9 עשוי להיות כלי חשוב לעיכוב תפקודו של האונקוגן ST8SIA1 בטיפול ב-TNBC.
NAT1 הוא אנזים מטבולי המזרז את היווצרותן של תרכובות קסנוביוטיות בשלב II ומתבטא כמעט בכל הרקמות האנושיות. NAT1 יכול להשתמש בקופקטור חומצה פולית כדי לכוון את אצטיל-CoA (acetyl-CoA) גם בהיעדר מצע אמין ארומטי (Stepp et al., 2015; Laurieri et al., 2014). מחקרים הראו כי NAT1 מווסת את תפקוד המטריצה מטלופרוטאינאז 9 (MMP9) במודלים של תאי סרטן השד ומגן מפני מיני חמצן ריאקטיביים (ROS) במהלך מחסור בגלוקוז (Wang et al., 2018). מחיקת NAT1 הוכחה כמעכבת את קומפלקס פירובט דהידרוגנאז, מה שמוביל לתפקוד לקוי של המיטוכונדריה (Wang L. et al., 2019). בנוסף, דיווחים שונים אחרים הראו כי עיכוב NAT1 באמצעות מולקולות קטנות והשתקת siRNA יכול להפחית את הפולשנות וההתרבות של תאי סרטן השד (Stepp et al., 2018). לאחרונה, CRISPR/Cas9 שימש לדיכוי NAT1 בקו תאי סרטן השד MDA-MB-231, תוך השפעה על חילוף החומרים התאי בהתאם לרמת הביטוי שלו. מחקר זה הראה גם כי NAT-1 חיוני להתקדמות וגרורות של TNBC (Carlisle et al., 2020).
שעתוק מתואם של אונקוגנים מווסת על ידי משפרי-על, גורמי שעתוק וקופקטורים (Hnisz et al., 2015). בנוסף, קבוצה של קינאזות תלויות-ציקלין (CDKs), כגון CDK7, CDK8, CDK9, CDK12 ו-CDK13, נדרשות לוויסות שעתוק. ביניהם, CDK7 מעורב בזרחון של RNA פולימראז II, שהוא חשוב מאוד לתחילת והתרחבות שעתוק האונקוגן בפתוגנזה של TNBC. במחקר פורץ דרך, מחיקה של CDK7 על ידי CRISPR/Cas9 עיכבה TNBC, דבר המצביע על כך שהפתוגנזה של TNBC תלויה ב-CDK7 (Wang Y. et al., 2015).
מחקרים הראו שמוטציות ב-MYC וב-RBP (חלבון קושר RNA) יכולות להוביל לאפופטוזיס, בעוד שמוטציות בגן בודד ב-MYC או RBP אינן משפיעות על צמיחת תאי סרטן (Einstein et al., 2021). יותר מ-1000 RBPs בגנום האנושי נבדקו באמצעות ספרייה מבוססת CRISPR/Cas9. ביניהם, 57 RBPs נמצאו קריטיים לצמיחת תאי סרטן עם רמות MYC גבוהות מאוד (Wheeler et al., 2020). בנוסף, YTHDF2 חשוב לשמירה על צמיחת תאי TNBC ומפחית את כמות התעתיקים המתילטים במהלך שעתוק ותרגום ברמה גבוהה בתאי סרטן עם ביטוי MYC גבוה יותר. בנוסף, YTHDF2 אינו חיוני לתאי סרטן, אשר פחות תלויים ברמות MYC גבוהות כדי להאריך את הישרדותם של חולי TNBC (Einstein et al., 2021), דבר המצביע על כך שהוא עשוי להיות מטרה טיפולית פוטנציאלית לתרופות שיכולות להתגבר על TNBC.
חלבוני אצבע אבץ (ZNFs) מהווים כ-1% מכלל הגנום האנושי. מחקרים הראו כי ZNF יכול לווסת את התפשטות התאים בסוגי סרטן שונים, כגון סרטן הכבד, סרטן השד וסרטן המעי הגס (Zhang W. et al., 2021; Li et al., 2017). ספריות שנוצרו על ידי נוקאאוט של CRISPR שימשו לסינון גנים מדכאי גידולים שונים (TSGs) בתאי סרטן השד (Shalem et al., 2014). מאז, מחקר טרנסקריפטומי של תאי סרטן שד שנמחקו על ידי CRISPR/Cas9 ZNF319 הראה כי ZNF319 הוא גן מדכא גידולים המפחית את התפשטות סרטן השד ולכן מעורב במנגנוני איתות פוטנציאליים שונים ובתפקודים ביולוגיים אחרים (Wang L. et al., 2022).
פרופטוזיס הוא סוג של מוות תאי מתוכנת התלוי בנוכחות ברזל. ידוע כי התפתחות פרופטוזיס מושפעת מנוכחות של פרוקסידים של שומנים. בנוסף, דווח כי PKCβII מפגין חמצון מוקדם של שומנים, וחמצון מוגבר של שומנים קשור לפרופטוזיס. סינון ספרייה של מעכבי קינאז בתיווך CRISPR/Cas9 גילה כי PKCβII מעורב בתהליך חמצון השומנים, שהוא קריטי לפרופטוזיס בתאי MDA-MB-231 (Zhang et al., 2022). לכן, הדבר מצביע על כך שנוקאאוט של PKCβII על ידי CRISPR/Cas9 עשוי להיות מטרה פוטנציאלית של גן מדכא גידולים לטיפול במחלות הקשורות לפרופטוזיס (Zhang et al., 2022).
עמידות לתרופות נחשבת כאחראית לכ-90% ממקרי המוות בחולי סרטן והיא אחד האתגרים העיקריים בטיפול בסרטן (Bukowski et al., 2020). התוצאות מצביעות על כך שמספר מספיק של גנים הקשורים לפריקת תרופות, תיקון DNA, אפופטוזיס ומסלולי איתות תאיים שונים קשורים לעמידות לתרופות (Haider et al., 2020). ביניהם, מספר גנים טופלו על ידי כלי CRISPR/Cas9 והראו תוצאות מבטיחות בהפחתת עמידות לתרופות ובהגברת יעילותם של טיפולים אנטי-סרטניים (Vaghari-Tabari et al., 2022). בנוסף, ספריות סינון CRISPR/Cas9 בעלות תפוקה גבוהה נמצאו קשורות לשינוי תפקודן של מטרות פוטנציאליות של גנים לעמידות לתרופות (Shalem et al., 2015). כדי לזהות גנים של עמידות לפקליטקסל, ריצוף RNA בשילוב עם סינון ספריית sgRNA כלל-גנומית שימש לזיהוי שמונה גנים מועמדים, כולל היסטון דאאצטילאז 9 (HDAC9), הקשורים לעמידות לתרופות בחולים עם TNBC חוזר (B et al., 2020). במחקר אחר, נצפתה עלייה בביטוי של דיסרין/תראונין וטירוזין חלבון קינאז (DSTYK) במהלך הישרדותם של חולי TNBC שטופלו בתרופות נגד סרטן. יתר על כן, הפחתת DSTYK בתיווך CRISPR/Cas9 הגבירה משמעותית את האפופטוזיס של תאי סרטן עמידים לתרופות in vitro (תאי SUM102PT ותאי MDA-MB-468) ובמודל TNBC in vivo (Ogbu et al., 2021).
למרות של-TNBC יש הפעלה לא תקינה של מסלול MAPK, ההשפעה הקלינית של טיפולים המכוונים ל-MEK היא גרועה. בדיקת ספריית גנומים של CRISPR/Cas9 גילתה כי עיכוב של PSMG2 (Chaperone 2 להרכבת פרוטאום) הופך את תאי TNBC BT549 ו-MB468 לרגישות למעכב MEK AZD6244. הפחתת PSMG2 על ידי CRISPR/Cas9 שינתה את תפקוד הפרוטאזום הרגיל, מה שהוביל לפירוק של PDPK1 בתיווך אוטופגיה, ובכך שיפרה עוד יותר את תאי הגידול במודלים של עכברי TNBC המושרים על ידי AZD6244 (מעכב MEK) ו-MG132 (מעכב פרוטאזום). לפיכך, ניתן לתת מעכבי פרוטאזום ומעכבי MAP קינאז (MEK) באופן סינרגטי כדי להפחית את התפשטות תאי הגידול (Wang X. et al., 2022).
CRISPR/Cas9 שימש גם לסריקה לאובדן תפקוד גנים המוביל לעמידות ל-TNBC (Shu et al., 2020). Ge et al. הסבירו את מנגנון העמידות לתרופות של תאי סרטן שטופלו ב-JQ1, מעכב ברומודומיין BET (BBDI), ב-TNBC. באמצעות CRISPR/Cas9, הם מצאו שמחיקת הגן rb1 גרמה ל-TNBC להפוך עמידים לתרופה האנטי-סרטנית JQ1. לכן, תפקוד rb1 חשוב בתגובה לתרופות JQ1 ב-TNBC. הם דיווחו גם כי פקליטקסל הוא מעכב CDK4/6 קינאז/מיקרוטובולים, ושילובו עם BBDIs כגון JQ1 עשוי לספק תגובות טיפוליות מבטיחות ל-TNBC עמידים לתרופות (Ge et al., 2020).
דווח כי הנוף התעתוקי של RNA ארוך שאינו מקודד (lncRNA) אחראי לעמידות לטיפול ניאו-אדג'ובנטי ב-TNBC. מחקר זה מראה כי חמישה תעתיקי lncRNA שונים של MALAT1 מתבטאים מאוד ב-TNBC. בנוסף, מחיקה של MALAT1 בתיווך CRISPR/Cas9 הגבירה את הרגישות של תאי TNBC BT-549 לפקליטקסל ודוקסורוביצין, דבר המצביע על תפקיד פוטנציאלי לעמידות ל-MALAT1 ב-TNBC (Shaath et al., 2021).
מוטציות ב-BRCA1 (BRCA1m) הן הטרוגניות ולכן קשות לגילוי. מיקוד ב-PARP1 (פולי(ADP-ריבוז) פולימראז), השותף הקטלני הסינתטי של BRCA1, עשוי להגביר את הרגישות הכימית לתרופות בתאי TNBC. באמצעות CRISPR/Cas9, מחיקת PARP1 הגבירה את הרגישות של תרופות נגד סרטן כמו דוקסורוביצין, גמציטבין ודוסטקסל לתאי TNBC מוטנטיים mBRCA1, דבר המצביע על כך ש-PARP1 מעורב גם בעמידות לתרופות ב-TNBC (Vaghari-Tabari et al., 2022). מוטציות בגנים מדכאי הגידול BRCA1 או BRCA2 ידועות כמגבירות את הסבירות לפתח סרטן שד אצל אנשים. טיפול בחולות אלו דורש שימוש במעכבי PARP. בנוסף, הוכח כי נוקאאוט של גורם ההצלה של נוקלאוטידים DNPH1 באמצעות CRISPR/Cas9 יכול להסיר את הנוקלאוטיד הרעיל 5-הידרוקסימתילדאוקסורידין (hmdU) מונופוספט, ובכך לשפר את תגובת תאים חסרי BRCA לרגישות למעכבי PARP (Fugger et al., 2021). לפיכך, מעכבי CRISPR/Cas9 ומעכבי PARP1 עשויים להפוך לאסטרטגיית טיפול חשובה עבור TNBC.
הגן גליקופרוטאין החודר (P-gp) הוא גן עמידות לתרופות מרובות, שבדרך כלל מווסת כלפי מעלה בכ-41% מכלל תאי הגליקופרובידים (TNBC) (Sun et al., 2020). יציאת תרופות המושרה על ידי P-gp זוהה כווסת מפתח של עמידות לתרופות בסרטן השד. מעכבי P-gp הפגינו רגישות מוגברת לתרופות נגד סרטן בסרטן השד (Famta et al., 2021). לכן, אבלציה או דיכוי של P-gp ומעכבי P-gp בתיווך CRISPR/Cas9 עשויים להיות שיטות חשובות מאוד להתגברות על עמידות לתרופות ב-TNBC.
ידוע כי נשא הקסטות הקושר ATP G2 (ABCG2) גורם לעמידות לתרופות בסרטן טונוס (TNBC) (Palasuberniam et al., 2015), למרות שכרגע אין דיווחים על הקשר בין השתקת CRISPR/Cas9 ו- ABCG2 לבין השבתת גנים מדכאים גידולים. PTEN עשוי להגביר את הפעלת ABCG2 (Palasuberniam et al., 2015), (Deepak Singh et al., 2021). לכן, שימוש ב- CRISP/Ca9 להסרת ABCG2 ושילובו עם מעכב ABCG2 עשוי להיות טיפול מתאים להתגברות על עמידות לתרופות בסרטן טונוס (TNBC). טבלה 2 מזכירה CRISPR/Cas9 המכוון לכל גני העמידות.
טבלה 2. CRISPR/Cas9 מכוון לגנים שונים של עמידות ל-TNBC כדי להגביר את הרגישות של תאים לתרופות נגד סרטן.
ספריות CRISPR/Cas9 הן כלים פוטנציאליים לסינון מוטציות גנטיות הקשורות לפתוגנזה של סרטן (Chan et al., 2022). שיטת סינון זו כוללת ארבעה שלבים כגון (א) בניית ספרייה, (ב) התמרה לנטיוויראלית, (ג) סינון פנוטיפי, ו-(ד) ניתוח גן מטרה. למרות של-TNBC יש הפעלה חריגה של מסלול MAPK, הפרוגנוזה הקלינית של טיפול ממוקד MEK עבור חולי TNBC הנושאים מוטציות בגנים מדכאי גידולים כגון PTEN, RB1 ו-TP53 היא גרועה מאוד.
בנוסף, בדיקת נוקאאוט גנטית באמצעות CRISPR/Cas9 בחנה את המולקולה החזקה והסלקטיבית ביותר, דהידרוקטרול, הנמצאת בשפע בתמציות פרחים ועלים גואטמליות, כדי להבין את השפעת הדהידרוקטרול על MDA-MB-231. מנגנוני ציטוטוקסיות סלקטיבית של תאים. מאפייני גזע מזנכימליים של תת-סוגי TNBC. בדיקה מבוססת CRISPR/Cas9 זו גילתה גם כי HSD17B11, גן המקודד ל-17β-הידרוקסיסטרואיד דהידרוגנאז מסוג 11, מתבטא מאוד בתאי MDA-MB-231 ומובילה ליצירת דהידרופלקרינול ספציפי לתאי MDA-MB-231 (Grant et. al., 2020). לפיכך, הדבר מצביע על כך שלסקר גנומי של CRISPR/Cas9 יש פוטנציאל גדול בזיהוי המנגנונים העומדים בבסיס התכונות האנטי-סרטניות של תרכובות טבעיות פוטנציאליות.
בנוסף, נחקרה הפגיעות של תאי TNBC לסרטן באמצעות בדיקת CRISPR/Cas9 in vivo בלתי מוטה, אשר הראתה קשר בין מסלולים אונקוגניים ומדכאי גידולים. דווח כי מרכיבים מרכזיים של מסלולי mTOR ו-Hippo ממלאים תפקידים חשובים בוויסות גידולים ב-TNBC. בנוסף, מחקרים הראו כי עיכוב פרמקולוגי של mTORC1/2 ואונקופרוטין YAP מעכב ביעילות את הפתוגניות של TNBC באמצעות מודל סינרגיה של מטריצת תרופות in vitro וקסנוגרפטים שמקורם בחולים in vivo. יתר על כן, עיכוב mTORC1/2 בתיווך Torin-1 מגביר את המקרופינוציטוזה, בעוד שעיכוב YAP המושרה על ידי ורטפורפין מוביל למוות של תאי TNBC. יחד, תוצאות אלו מדגישות את העוצמה והחוסן של בדיקת CRISPR in vivo כלל-גנומית לזיהוי טיפולים חדשים ויעילים עבור TNBC (Dai et al., 2021).
חוסר ויסות של מערכת החיסון הוא גורם חשוב ביצירת גידולים. תאי סרטן מתחמקים מניקוי מערכת החיסון על ידי עקיפת מנגנוני הגנה, כולל הפרעה לפעילותם של תאי חיסון בסביבת הגידול ופגיעה במערכת החיסון. לכן, פיתוח מערכת חיסון משופרת עשוי להיות גישה מרכזית למאבק בגידולים. השימוש בשינוי גנים מבוסס CRISPR/Cas9 מטפל במספר סוגיות הקשורות לתפקוד לקוי של מערכת החיסון מנקודות מבט שונות. CRISPR/Cas9 שימש לשיפור החסינות נגד גידולים נגד סרטן השד באמצעות המסלולים הבאים (איור 3).
איור 3. אימונותרפיה באמצעות CRISPR/Cas9 מכוונת לתאי TNBC. אובדן CDK5 והפחתה של PDL1 ו-CD155 מחזקים את מערכת החיסון. באופן דומה, אובדן A2AR והפחתה של TAAs כגון HER2, mucin 1 ו-TEM8 הגבירו את יעילותם של תאי CAR-T בהריגת תאי סרטן. בדיקות סקר לתאי T המונעות על ידי CRISPR/Cas9 הראתה כי שיבוש של p38 קינאז משפר את פעילות תאי T נוגדת גידולים. תאי T שעברו שינוי על ידי CRISPR/Cas9 מגבירים את הביטוי של TCR (קולטן תאי T), וכתוצאה מכך לתאי T יש פעילות נוגדת גידולים.
מטרת האימונותרפיה היא לעורר את מערכת החיסון לתקוף תאי סרטן. ביטוי יתר של חלבוני מחסום חיסוניים מונע בדרך כלל תגובות אוטואימוניות אך עשוי לסייע לסרטן להימנע מהן (Topalian et al., 2015). חלבונים אלה מונעים תגובות חיסוניות על ידי קשירה לקולטנים על פני תאי החיסון. חלבוני מחסום מרובים (כגון CD155 ו-PD-L1) מכוונים לקולטן PD-1 על תאי חיסון ומתבטאים בסרטן השד, במיוחד בסרטן השד TNBC (Li Y.-C. et al., 2020). דיכוי של PD-L1 או הקולטן שלו באמצעות CRISPR/Cas9 יכול לעורר את מערכת החיסון לתקוף גידולי TNBC (Yahata et al., 2019). בנוסף, הורדת ביטוי PD-L1 באמצעות מחיקה של CDK5 בתיווך CRISPR/Cas9 הוכחה כמעכבת צמיחת גידולים in vitro ו-in vivo (Deng et al., 2020). עיכוב גדילה במודלים in vitro ו- in vivo של סרטן השד מצביע על כך שהפחתה של CD155 בתיווך shRNA עשויה להיות בעלת השפעה טיפולית על סרטן השד (Gao et al., 2018).
תאי T מסוג CAR מבטאים אנטיגנים הקשורים לגידול (TAAs) ויכולים להשתמש ב"נוקאאוט" של חלבוני מחסום כדי לשפר את פעילותם (Li C. et al., 2020). ישנן מטרות פוטנציאליות שונות לטיפול בתאי T מסוג CAR בסרטן השד, כולל מספר TAAs כגון HER2, mucin1 ו-TEM8 (Bajgain et al., 2018). ישנן עדויות לכך שתאי T מסוג CAR המכוונים למזותלין (המתבטא ביתר בתאי TNBC BT-459) יעילים יותר כנגד סרטן כאשר PD-1 מופסק באמצעות CRISPR/Cas9 (Hu et al., 2019). עם זאת, בידוד תאי T מחולים ולאחר מכן עריכתם ex vivo הוא תהליך עתיר עבודה וגוזל זמן. למרות שתאי T אוניברסליים יכולים להפחית את דרישות הבידוד, יש להסיר תאי T תורם המבטאים אנטיגן לויקוציטים אנושי (HLA) מחלקה I וקולטן תאי T (TCR) כדי למנוע אנומליות של השתל נגד המארח (Ren et al., 2017, 2017a). באמצעות CRISPR/Cas9, HDR יכול לחסל בו זמנית TCR ו-HLA ולחסל את הגן המקודד ל-CAR. מחקרים הראו שניתן להשתמש ב-CRISPR/Cas9 כדי להכניס תאי CAR אנטי-CD19 למוקד TCR, ובכך לייצר ביעילות תאי CAR מבלי לדלדל תאי T (Dimitri et al., 2022). פותחו טכנולוגיות מולטיפלקס ליצירת תאי T CAR אלוגניים על ידי חיסול בו זמנית של TCR, בטא-2-מיקרוגלובולין (B2M), תת-יחידה HLA-I וחלבונים אחרים כגון PD-1 ו-CTLA-4, אשר עשויים להיות בעלי תכונות נוגדות סרטן טובות יותר כנגד TNBC (Eyquem et al., 2017; Liu et al., 2017; Ren et al., 2017b; Dimitri et al., 2022).
שימוש ב-CRISPR/Cas9 יכול לשפר את יעילותם של תאי CAR-T. ידוע כי אדנוזין בעל תכונות מדכאות חיסון ויכול להפחית את החסינות נגד סרטן על ידי חסימת תפקוד תאי T והפעלת קולטני אדנוזין A2A (A2AR) (Vigano et al., 2019). השתקת A2AR באמצעות CRISPR/Cas9 שיפרה משמעותית את יעילותם של תאי CAR-T in vivo (Giuffrida et al., 2021). ידוע כי תאי T מציגים מאפיינים פנוטיפיים שונים כגון התפשטות תאית, התמיינות, עקה חמצונית ועקה גנומית. בדיקות סקר של תאי T מבוססות CRISPR/Cas9 גילו שיבוש של 25 קינאזות שונות של קולטני תאי T. ביניהן, מחיקה של קינאז p38 הוכחה כמשפרת את הפעילות האנטי-גידולית של תאי T, דבר המצביע על כך ש-p38 קינאז הוא מווסת מפתח של ויסות תאי CAR-T (Gurusamy et al., 2020).
ניתן לשנות גנטית תאי T באמצעות CRISPR/Cas9 כדי לייצר תאי TCR בעלי ביטוי גבוה. העברת תאי T מהונדסים גנטית לחולים הראתה פעילות אנטי-סרטנית חזקה יותר מאשר תאי T אנדוגניים. לכן, תאי TCR אנדוגניים עשויים להתחרות ב-TCRs שעברו שינוי גנטי בחולים, דבר שעשוי להשפיע על הפוטנציאל של אימונותרפיה לסרטן. כדי להתגבר על בעיה זו, שימוש ב-CRISPR/Cas9 להסרת TCR-β אנדוגני בתאי המקבל ולאחר מכן העברת תאי TCR-β לחולי סרטן עשוי להפגין תגובות חיסוניות אנטי-סרטניות טובות יותר ללא צורך בתחרות מינית אנדוגנית של TCR (Fan et al. 2018). לפיכך, למעט תאי T שעברו שינוי CRISPR, תאי TCR רגישים פי אלף לאנטיגנים של גידול מאשר תאי T רגילים שעברו העתקה של TCR. בנוסף, בלוקמיות שונות, תאי T שעברו שינוי שנוצרו על ידי γδ TCR+ CRISPR מפגינים ביטוי גבוה יותר של תאי T CD4+ ו-CD8+ מאשר העברה סטנדרטית של TCR (Legut et al., 2018). לכן, תאי T שעברו שינוי שנוצרו על ידי CRISPR/Cas9 עשויים להיות שיטת אימונותרפיה יעילה להתגברות על TNBC.
אינטגרינים הם מולקולות הידבקות תאים הנמצאות בממברנות תאיות ומקדמות את הקישור של תאים למטריצה החוץ-תאית (ECM) (Hamidi and Ivaska, 2018). הפרעה באינטגרינים קשורה להתפתחות ונדידה של סרטן על ידי שינוי המטריצה החוץ-תאית, מה שמוביל להישרדות תאי סרטן במחזור הדם (Hamidi and Ivaska, 2018). הפחתת אינטגרינים בתיווך CRISPR/Cas9 מאטה את התקדמות הגידול, גרורות והתיישבות בסרטן כרוני מסוג TNBC. הפחתת אינטגרין a5 (ITGA5) דווחה כמפחיתה נדידת תאים והתקדמות בסוגי סרטן אחרים כמו סרטן ריאות (Ju et al., 2017), דבר המצביע על כך שאינטגרין a5 עשוי להיות גם גורם מפתח בפתוגנזה של TNBC.
יצירת עכברי נוקאאוט באמצעות שיטות מסורתיות של תאי גזע עובריים (ES) היא תהליך עתיר עבודה, גוזל זמן ולא יעיל. לוקח חודשים ושנים למקד תאי ES באמצעות רקומבינציה הומולוגית, להתרבות עכברים כימריים ולאחר מכן להכליא אותם עם עכברים הטרוזיגוטים כדי לייצר צאצאים הומוזיגוטים. נדרשת הכלאה מורכבת כדי ליצור עכברים עם מוטציות גנטיות מרובות. עם זאת, בעיות רבות התעוררו בעת שימוש בעכברים שנוצרו על ידי אבלציה של תאי ES באמצעות CRISPR/Cas9 או על ידי הזרקת מיקרו של רכיבי CRISPR/Cas9 לתוך ביציות מופרות של תאים בודדים. לדוגמה, החדרת שינויים מתרחשת לעתים קרובות בלוקוסים ביאלליים ואינה ספציפית לגן. לאחרונה דווח כי תאי ES המשתמשים בטכנולוגיית CRISPR/Cas9 יכולים להכניס בו זמנית מוטציות ביאלליות לעד 5 גנים (Nishizono et al., 2021). למטרה זו, mRNA של Cas9 וחמישה gRNAs ספציפיים לגן הועברו בו זמנית לתאי ES. ממצא זה מדגיש את ההבטחה והיעילות של הליך זה, למרות שייתכן שמוטציות אלו עברו הלכה למעשה כאשר שורות מייסדים גודלו כדי לייצר עכברי נוקאאוט חמישיים. המחקר מדווח גם על תגלית מפתיעה: תאי גזע עובריים אינם נדרשים עוד כדי ליצור עכברים מהונדסים גנטית. במקום זאת, כדי להסיר תוצרי גנים ספציפיים, הוזרקו mRNA ו-gRNA של Cas9 לעוברים בשלב תאי בודד. כתוצאה מכך, נוצרו שורות מייסדים מסוג נוקאאוט שניתן תיאורטית להשתמש בהן כדי לחקור את ההשלכות של מחיקת גנים בעכברים (Qin et al., 2016). לפיכך, CRISPR/Cas9 מאפשר יצירת עכברים טרנסגניים לטיפול ב-TNBC בעלות נמוכה יותר מהנדסה גנטית מסורתית. באמצעות מערכת CRISPR/Cas, פותח מודל עכבר נוקאאוט חדש שיכול להכניס בהצלחה מוטציות נקודתיות בגן אנדוגני אחד או יותר ב-TNBC. בהתבסס על תפיסה זו, ניתן גם לפתח מודלים של בעלי חיים של TNBC באמצעות מחיקה של BRCA1 ו-p53 בתיווך CRISPR/Cas9, וכתוצאה מכך אובדן תיקון HR, חוסר יציבות גנומית ופנוטיפים מוטנטיים (Annunziato et al., 2020).
כיום, שיטות שונות כגון ממוגרפיה, דימות תהודה מגנטית (MRI) ואולטרסאונד משמשות לאבחון TNBC. עם זאת, לשיטות אלו יש מגבלות מסוימות. ממוגרפיה משמשת לאבחון רקמת שד מקומית ולא גרורות, שבהן תאי סרטן נדדו לאיברים אחרים. אולטרסאונד אינה שיטה אמינה לאבחון TNBC (Chen and Lee-Felker, 2023). ל-MRI רגישות גבוהה יותר מאשר אולטרסאונד וממוגרפיה, אך דיוק האבחון שלה מוגבל (Sha and Chen, 2022). ביופסיה של רקמות היא דרך פולשנית לזיהוי תאי סרטן. עם זאת, במקרים מסוימים, ביופסיה עלולה לפספס רקמה סרטנית אם המחט סוטה מהאזור הרצוי. בנוסף, היא יקרה מאוד ויכולה להיות טראומטית עבור המטופלת. TNBC הוא סוג הטרוגני של סרטן, ולכן ביופסיה עשויה לא לספק מספיק מידע על סוג הסרטן. לכן, יש צורך דחוף בשיטה חדשה ואמינה מבחינה אבחנתית לגילוי TNBC. CRISPR/Cas9 עשוי לשמש כחלופה רגישה ביותר ומינימלית פולשנית לאבחון סרטן השד. לשם כך, ניתן להשתמש באסטרטגיות מבוססות CRISPR/Cas9 כדי לשפר את שיטות ה-PCR לאבחון TNBC. ראשית, חלבוני Cas9 ו-cpf1 של מערכת CRISPR משמשים להסרת DNA לא ספציפי, ולאחר מכן שני חלבונים אלה (Cas9 ו-cpf1) יכולים לזהות את רצף ה-PAM לפני שהם נקשרים ל-DNA המטרה (Deepak Singh et al., 2021). לפיכך, PCR יכול לזהות מוטציות הקשורות להתפתחות סרטן. מספר מחקרים אימצו אסטרטגיה מבוססת CRISPR זו כדי לזהות מוטציות שונות בסוגי סרטן שונים (Safari et al., 2019). לפיכך, שיטות PCR מבוססות CRISPR עשויות להפחית את התלות של אבחון TNBC בשיטות פולשניות כגון אימונוהיסטוכימיה מבוססת ביופסיה.
שינויים גנוטיפיים בוויסות קולטני הורמונים הודגמו גם בחולי TNBC (Chen and Russo, 2009). אסטרטגיות PCR מבוססות CRISPR/Cas9 המשתמשות במיקרו-מערכים לאבחון נקודתי יכולות לנטר ביעילות מוטציות אלו (Hajian et al., 2019). הן יכולות גם לספק לספקי שירותי בריאות מידע רלוונטי על מוטציות ספציפיות בחולי TNBC, דבר שיכול לסייע בשיפור מהלך הטיפול שלהם. עם זאת, לטכניקה משולבת זו יש מגבלות. לכן, נדרשים מאמצי מחקר נרחבים לפני שניתן יהיה להשתמש בשיטת CRISPR/Cas-PCR זו בתחום הבריאות לאבחון TNBC (Yang et al., 2019).
זמן פרסום: 14 באוקטובר 2024